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用高碘酸氧化多糖时，醛基被游离出来，而显Schiff 阳性反应，这种 Schiff 反应称为PAS（Peri- odic Acid Schiff）反应。自 J.E.A.McManusiu（1946.1948）、R.D.Hotchkiss（1948）以来，一直被用作为多糖的组织化学检测方法。 将固定好的切片用水及酒精洗涤以0.5％ HIO4处理，它能氧化糖类及有关物质中的1，2-乙二醇基，使之变为二醛，待充分洗去HIO4后，浸于Schiff试剂中，醛与Schiff试剂能结合成一种品红化合物，产生紫红色，因而含多糖部位就被染成红色。 糖原染色是病理学中常规的染色方法之一，不仅能够显示糖原，还能显示中性黏液性物质和某些酸性物质以及软骨、垂体、霉菌、真菌、色素、淀粉样物质、基底膜等。此反应基于1，2-乙二醇基（-CHOH- CHOH）的存在，大部分多糖都出现阳性，但是除多糖外，有些脂质和蛋白质也有阳性反应，故需要做除去脂质和蛋白质的切片标本对照试验。核酸没有乙二醇基，所以是阴性。 溶液配制 1、0.5%～1%高碘酸钠溶液 0.5g 过碘酸 (HIO4)溶于100 mL 蒸馏水或者70%酒精溶液中, 或者按如下配方配制: 过碘酸 0.8 g, 95%乙醇70 mL 醋酸钠 0.27 g水20 mL。 2、Schiff 氏液（无色品红溶液） 在三角烧内加入蒸馏水500 mL ，煮沸后，在保持微沸的情况下，加入碱性品红 2.5 g，并不断摇动约 5 min（勿使之沸腾），使碱性品红彻底溶解（溶解液为深红色）。冷却到 50℃时，过滤，加入 1 M盐酸50 mL，再待冷却至 25℃时加入偏重亚硫酸钠2.5 g，塞住瓶口，摇动容器以充分混合（此时颜色明显变淡），然后避光放置或冰箱内24 h，溶液为淡黄或淡红色，再加入活性炭5 g，混合后振荡数分钟，静置 1 h，再用双层滤纸过滤 ,此时溶液应完全无色、清澈透明，为无色品红。封口，贮存于棕色瓶中（最好外包黑纸避光）存放入 4℃冰箱备用。 3、1 M盐酸 浓盐酸（比重 1.19 含量 22% ）8.5 mL加蒸馏水 91.5 mL。 4、偏重亚硫酸钠 1 M盐酸 7.5 mL 加10%偏重亚硫酸钠（钾）7.5 mL, 再加130 mL 蒸馏水混合而成。 5、苏木素染液 苏木素0.9 g，95%乙醇10 mL铵（钾）明矾20 g 双蒸水200 mL将苏木素溶于 95%的乙醇，钾明矾溶于水（可加热），然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化汞0.5 g，迅速搅拌，成深紫色，迅速移入冷水中，次日过滤，临用时取此液95 mL加冰醋酸5 mL，可使细胞着色清楚。 6 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液， Carnoyfixative） 配方Ⅰ：纯酒精 3 份 + 乙酸 1 份 配方Ⅱ：纯酒精 6 份 +乙酸 1 份 + 氯仿 3 份 配方Ⅲ：甲醇 6 份 +乙酸 1 份 + 氯仿 3份 适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。固定时间不宜过久。 实验步骤： 1、新鲜组织编号取材后 ,投入固定液。 2、入无水酒精中脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。 3、常规切片：厚 5μm。 4、脱蜡至水： （1）二甲苯中脱蜡 10 分钟× 3 次，用吸水纸吸干液体； （2）100%乙醇 5 分钟× 2 次，用吸水纸吸干液体； （3）95%乙醇 5 分钟× 2 次，用吸水纸吸干液体； （4）流水 2 分钟，用吸水纸吸干水分； 5、入0.5%～1%高碘酸氧化15 min，环境温度以不高于20℃为宜，室温高时氧化时间适当缩短。 6、流水冲洗 5 min 7、蒸馏水浸洗 2 次 8、Schiff 氏液（Schiff 氏液从冰箱取出升至室温使用）避光染色10～30 min; 9、 0.5%偏重亚硫酸钠（钾）浸洗 2 次，每次1～2 min,以达到分化的目的 ; 10、流水冲洗 5～10 min 11、蒸馏水洗 12、Harris 苏木精染 2～5min 13、自来水洗 14、1%盐酸酒精分化 15、再用自来水充分冲洗 16、温水（或者1%氨水）返蓝，核染色稍浅为好 17、流水冲洗 18、95%乙醇脱水 5分钟 × 2 次，用吸水纸吸干液体； 19、100%乙醇 5 分钟 × 2 次，用吸水纸吸干液体； 20、二甲苯中透明 5 分钟 × 2 次，用吸水纸吸干液体； 结果显示 阳性反应，胞浆呈红色，阴性反应，胞浆呈无色； 在正常血片中红细胞不染色； 血小板染成深红色； 中性粒细胞胞浆染成红色或深红色，有些细胞有阳性颗粒； 单核细胞的胞浆染成淡红色，可含有细小或粗大阳性颗粒； 少数淋巴细胞的胞浆内含有少许小的淡红色或红色颗粒； 正常骨髓的幼稚细胞和有核红细胞都不染色； 巨核细胞的胞浆内呈弥散红色或深红色； 巨核细胞的胞浆内呈弥散红色或深红色。 注意事项： 1、染色过程中不能接触伊红，以免造成颜色误差。 2、试剂均应低温保存，临用前半小时取出恢复室温。 3、高碘酸处理温度以不高于20℃为宜，室温高时，处理时间可适当缩短。Schiff染液染色时间可随温度调整，室温高可减少染色时间，冬季室温低，可延长至20 min左右。 4、如果10%福尔马林固定液固定组织染色效果不好，可改用PAS染色的标本固定液宜采用乙醇性固定液。 5、尽可能选取小块新鲜组织及时固定。 6、糖原易溶于水，在酶的作用下很容易分解为葡萄糖，更易溶于水，固定之前决不能用水或生理盐水等浸洗。 7、组织在4℃左右温度内固定与保存，是针对糖的性质和避免糖原溶于水而采取的相应措施。 8、乙醇能沉淀白蛋白、球蛋白，亦能使核蛋白和糖原沉淀，但仍可溶于水，因此最好不单独使用乙醇固定，以酒精为溶剂配制的含甲醛、冰醋酸及苦味酸等混合固定液为好，此类固定液具有固定作用迅速，利用酒精防止糖原溶解于水，利用冰醋酸和苦味酸的膨胀及软化作用，抵消酒精对组织的收缩硬脆，利用甲醛对组织固定的渗透力强、固定均匀等优点，其固定原理是使与糖原相结合的蛋白质凝固，糖原被周围凝固的蛋白质保护起来，而不是凝固糖原，因此固定效果好。 9、作糖原染色时，最好作消化对照，即取两张连续切片，其中一张脱蜡至水后，用1%淀粉酶于37℃消化30 min，水洗后与不经消化处理的切片一起置0.5%高碘酸液氧化，如经消化处理的切片染色阴性，不经消化处理的切片染色阳性，即肯定为糖原。 10、偏重亚硫酸钠（钾）溶液配置后，不能保存，因此必须现配现用，用过一次即应废弃。 11、: 组织质地不同，切片厚度和染色时间亦不同。肝组织的糖原成分遇水易分解丢失,因此处理组织时忌过度冲洗,无色品红着色一般 3～5 min , Mayer苏木素复染 15～20 s 即可。肝脏的切片厚度一般在 3 μm为宜，组织太厚或太薄均不利于观察细胞内空泡状结构。肾穿刺组织切片一定要薄，厚度控制在 2 μm，无色品红的染色时间一般在15～20 min之间，Mayer 苏木素复染则应在 40 s 左右。含粘液成分的组织和含霉菌成分的组织切片厚度一般在 4 μm以内，品红着色 5～10 min , Mayer 苏木素复染 25～30 s之间即可。 |
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