|
缺血性心血管疾病，以中风、CLI和MI为代表，已成为全球发病率和死亡率的主要原因，在生理和病理条件下，包括发育、伤口愈合、缺氧和缺血等，血管新生对维持血管稳态至关重要，对宿主修复和治疗干预都具有决定性作用。血管新生包括血管血皮细胞（ECs）的激活、增殖、迁移、分化、分支、吻合、管腔形成以及从原有的血管重塑成动脉和静脉。血管新生是器官生长和各种疾病的重要病理生理过程，高效的血管生成有助于缺血性疾病，如缺血性心脏病或严重肢体缺血，然而，过度和不平衡的血管生成导致恶性、炎症和视网膜疾病。转录因子Sp1/Sp3是胎儿发育和肿瘤生长所必需的。最近研究发现sp1和Sp3似乎与血管生成密切相关，尤其是血管内皮生长因子。然而，内皮Sp1/Sp3在体内血管生成中的作用尚未得到很好的研究。近期，来自山东大学张文程教授团队在《Nature Communications》上发表了Angiotensin-converting enzyme inhibitor promotes angiogenesis through Sp1/Sp3-mediated inhibition of notch signaling in male mice一文， 揭示了内皮细胞USP7-Sp1/Sp3Notch1信号在ACEI治疗反应的病理生理性血管生成中起着核心作用。 
图1: 敲除ECs中的Sp1/Sp3可减少体内血管生成作者首先使用免疫荧光染色评估了Sp1/Sp3在人类样本中的表达，发现与健康对照组相比，CLI患者腓肠肌样本中与核(DAPI)和cd31标记的血管内皮共定位的Sp1/Sp3在肌纤维周围和血管周围显著减少。接着作者构建了VE-CAD-CreERT2+/Sp1fl/fl/Sp3fl/fl (dKO)小鼠， 使用视网膜血管生成模型来检测P5幼崽小鼠视网膜中的血管生成萌芽，小鼠后肢缺血(HLI)模型检测修复性血管生成反应，皮肤伤口愈合模型被用来估计宿主对损伤的防御反应，以及肿瘤模型中观察血管新生，揭示了人类和啮齿动物Sp1/Sp3下调导致血管生成条件减弱，减少体内血管生成。
已有的文章证明，ACEI促进体内血管生成，接着，作者研究了Sp1/Sp3上调是否有助于ACEI诱导的出生后血管生成的原血管生成表型，发现ACEI治疗无法增加dKO小鼠的视网膜血管面积、血管长度、分支点、尖端细胞和尖端芽的数量。通过体外主动脉环发芽模型验证Sp1/Sp3在acei介导的促血管生成作用中的作用。与体内试验相对应，来自dKO小鼠的主动脉环对ACEI无反应。体外实验中作者从CTR和dKO小鼠中分离出小鼠肺内皮细胞(MLECs)，证明ECs中的Sp1和Sp3在ACEI的促血管生成作用中起着重要作用。 图3：ACEI通过Sp1/Sp3促进病理性血管生成
为了研究内皮Sp1/Sp3在ACEI存在的成人病理性血管生成中的作用，作者使用了HLI小鼠模型，显示ACEI无法增加dKO小鼠腓肠肌内血流恢复和CD31+毛细血管密度。作者进一步采用了皮下Matrigel堵塞血管生成实验和肿瘤血管生成实验证明，内皮Sp1和Sp3在ACEI介导的生理性和病理性血管生成中起关键作用。
为了探究Sp1/Sp3缺失如何消除ACEI在血管生成中的作用，以及ACEI是否直接调节内皮细胞的Sp1/Sp3，作者使用siRNA来研究关键的去泛素酶，在用ACEI预处理过的人脐血管内皮细胞(HUVECs)中，只有usp7缺陷的siRNA降低了Sp1和Sp3蛋白水平，USP7属于最大的泛素特异性蛋白酶(USP)家族。使用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132减弱USP7 siRNA诱导的HUVECs Sp1/Sp3降低，环已酰亚胺处理后USP7的下调显著损害了Sp1/Sp3的稳定性。为了确定USP7对ACEI治疗小鼠视网膜萌芽血管生成增强的贡献，作者测试了两种选择性USP7抑制剂P22077和P5091在视网膜血管生成中的作用，P5时视网膜血管发育分析显示，选择性USP7抑制剂P22077-或p5091 -处理的小鼠表现出延迟性血管丛扩张，在发育中的脉管系统，叶尖细胞、叶尖芽和丝状足的数量减少，体外实验HUVECs的结数和相对管长减少，都证明了抑制USP7对于血管生成的抑制作用。在HLI条件下，小鼠的USP7抑制也表现出有害的表型。证明内皮细胞中USP7保护的Sp1/Sp3有助于ACEI的促血管生成作用。  图5：ACEI通过USP7介导的去泛素化稳定Sp1/Sp3蛋白USP7是一种去泛素化酶，通过直接去泛素化来控制蛋白水平，因此作者提出假设：USP7通过与Sp1和Sp3相互作用导致其去泛素化来调节Sp1和Sp3的稳定性，为了验证这一假设，作者进一步研究了USP7对Sp1和Sp3多泛素化的影响。在HEK293T细胞中，异位表达USP7-WT，在共免疫沉淀(Co-IP)实验中降低了Sp1和Sp3的泛素化水平，在USP7抑制剂P22077和P5091处理的HEK293T细胞中也观察到类似的现象。接着，通过在HUVECs中过表达USP7- wt或USP7- cs（催化失活突变体USP7-CS），发现USP7- cs完全抑制了ACEI诱导的血管生成。为了进一步验证Sp1/Sp3上的多泛素链被USP7去除，作者将突变体转染HEK293T细胞，结果显示，K48的突变明显破坏了USP7介导的Sp1/Sp3去泛素化，USP7和Sp1/ Sp3之间依赖于USP7的n端trf样结构域(1-208 aas)的相互作用。定量ChIP实验中，ACEI处理增强了NOTCH1启动子上Sp1或Sp3的富集。相比之下，P22077或P5091处理显著削弱了观察到的ACEI诱导富集的增加。上述实验证明，USP7通过增加Sp1/Sp3的积累，在ACEI介导的Sp1/Sp3转录功能上调中发挥关键作用。乙酰化被认为是蛋白质中的一种进化保守修饰，在蛋白质稳定性中发挥重要作用，为了阐明乙酰化在Sp1/ Sp3稳定性调控中的机制，用阻断HDAC1的抑制剂TSA或SAHA处理HUVECs，以及HDAC1 siRNA转染到HUVECs，这些处理都能消除ACEI引起的USP7和Sp1/Sp3相互作用的增加。考虑到HDAC1抑制对Sp1/ Sp3泛素化的促进作用，我们生成了Sp1和Sp3突变体，Co-IP实验显示，与野生型Sp1或Sp3相比，Flag-Sp1-K703A或Flag-Sp3-K551R与USP7的相互作用更强。结果表命在ACEI存在的情况下，HDAC1介导的Sp1/Sp3去乙酰化导致它们与USP7的相关性增加。为了探究ACEI处理的内皮细胞中Sp1/Sp3去泛素化的增加是否与USP7核定位相关，作者在核亚细胞部分分别使用Sp1或Sp3抗体进行免疫共沉淀试验，发现USP7与Sp1/Sp3结合的时间延长，ACEI处理后Sp1/Sp3的泛素化水平降低，USP7转位进入细胞核，免疫荧光染色证实了USP7的亚细胞分布。接着作者发现lys703位点Sp1乙酰化和Lys551位点Sp3乙酰化在ECs内ACEI诱导的血管生成反应中抑制HDAC1 siRNA修饰HUVECs管的形成。上述数据表明，在ECs中ACEI的促血管生成功能期间，USP7在细胞核中积累，它与Sp1/Sp3结合，保护Sp1/Sp3免受蛋白酶体降解。
图7：内皮Sp1/Sp3负向调控Notch信号以调控血管生成为了研究ECs中Sp1/Sp3和Notch信号通路之间的潜在联系，作者从dKO小鼠的视网膜ECs中提取蛋白和mRNA，发现ECs中Sp1/Sp3缺失导致Notch1、NICD及其靶基因DLL4蛋白水平显著升高，NOTCH1及其主要下游靶效应物HES1、HEY1和DLL4 mRNA表达水平显著上调，免疫荧光染色证实Sp1/Sp3缺陷诱导的Notch1上调。作者进一步使用γ-分泌酶抑制剂DAPT (N- [N-(3,5 -二氟苯乙酰基)-l-丙酰]-s-苯甘氨酸-丁基酯)处理，DAPT处理在视网膜血管面积、血管长度、分支点以及尖端细胞、尖端芽和绢足的数量方面均显著增加了血管密度和血管丛的扩张。后肢缺血模型证实，DAPT可改善缺血引起的病理性血管生成过程中内皮细胞Sp1/Sp3缺失的损害。Notch1介导的VEGF信号通路是EC迁移、增殖和毛细管形成的关键驱动因素。在LLC异种移植的dKO小鼠肿瘤中，CD31标记的血管中VEGFR2表达下调，Notch1表达上调。作者进一步通过用mithramycin (Sp1和Sp3抑制剂)治疗HUVECs来检测Sp1/Sp3在VEGF信号通路中的作用，发现用mithramycin或Ad-NICD过表达NICD处理导致VEGF诱导的VEGFR2磷酸化及其下游信号p-PLCγ (Y783)和p-ERK1/2 (T202/Y204)显著降低。体外毛细血管形成实验和dKO小鼠的主动脉环实验表明，VEGF和Ang1共同作用促进dKO MLECs的血管生成，提示Sp1/Sp3缺失只是阻断了VEGF信号，在用ACEI预处理的HUVECs中，P22077和P5091显著抑制vegf诱导的VEGFR2、PLCγ和ERK1/2磷酸化，证明了Notch1-VEGFR2信号通路参与ACEI-Sp1/Sp3调控血管生成的机制。
图8：Sp3增强了Sp1介导的Notch1在ECs中的转录抑制活性为了进一步探索Sp1和Sp3的不同作用，用Sp1或Sp3 siRNA处理HUVECs。敲除导致Notch1、NICD和DLL4蛋白水平上调，Notch1、HES1、HEY1和DLL4 mRNA水平上调。接着过表达(OE) ECs中进行siRNA介导的Sp1敲除或在Sp1 OE ECs中进行Sp3敲除。Sp3 OE ECs中的Sp1下调导致Notch1信号强烈激活，Sp3 siRNA处理的Sp1 OE ECs不激活Notch1信号，表明sp3介导的Notch1信号的失活依赖于Sp1的存在，同时使用Sp1和Sp3 siRNA下调表达诱导Notch1信号进一步上调，表明Sp1和Sp3之间存在合作关系。Sp1/Sp3通过与靶基因调控区域的GC-box序列结合来调节转录。一些GC-box基序靠近NOTCH1转录起始位点(TSS)。利用染色质免疫沉淀(ChIP)验证了Sp1和Sp3与NOTCH1启动子相互作用。为了进一步了解Sp1和Sp3对NOTCH1的转录调控，作者克隆了NOTCH1荧光素酶报告基因上游不同的截断启动子，在-68到-35段观察到NOTCH1启动子活性，这表明这种最小的Ad-Sp1和Ad-Sp3响应元件在调节NOTCH1转录中起作用。进一步验证NOTCH1启动子中Sp1和Sp3的假定转录因子结合位点，作者准备了单个位点的替代突变，与野生型启动子相比，这导致转录抑制活性显著降低。此外，siRNA敲除HEY1/HES1减弱了adnicd诱导的VEGFR2启动子抑制，这些结果表明Sp1/Sp3结合NOTCH1启动子并抑制其转录。为了确定内皮Sp1和Sp3在促进血管生成中的独立作用，研究发现Sp1ECKO小鼠和Sp3ECKO小鼠的视网膜在血管发育表型上表现出轻微的延迟。此外，来自Sp1ECKO小鼠的视网膜比Sp3ECKO小鼠表现出更严重的血管生成受损，这表明Sp1在ECs血管生成中的作用优于Sp3。综上所述，这些发现表明Sp3可以增强sp1介导的NOTCH1在ECs中的转录抑制活性。本文研究结果表明，内皮Sp1/Sp3通过抑制NOTCH1转录在血管生成中发挥重要作用，并为内皮Sp1/Sp3作为各种血管生成相关疾病(包括视网膜疾病)治疗的潜在靶点提供了见解，CLI，甚至肿瘤。此外，通过HDAC1介导的去乙酰化和USP7介导的Sp1/Sp3的去泛素化描述了ACEI的促血管生成作用与Notch/VEGFR2系统之间的联系，这有助于研究ACEI的药理作用。参考文献：Lu H, Yuan P, Ma X, Jiang X, Liu S, Ma C, Philipsen S, Zhang Q, Yang J, Xu F, Zhang C, Zhang Y, Zhang W. Angiotensin-converting enzyme inhibitor promotes angiogenesis through Sp1/Sp3-mediated inhibition of notch signaling in male mice. Nat Commun. 2023 Feb 9;14(1):731. doi: 10.1038/s41467-023-36409-z. PMID: 36759621; PMCID: PMC9911748.
|
