如何做好烟草叶片瞬时表达

基于农杆菌侵染的烟草叶片瞬时表达系统是当下最实用、简便且强大的植物在体基因功能验证体系，几乎每一篇涉及植物基因功能验证的实验性论文都会用到这项技术。常见的具体应用包括：蛋白亚细胞定位（荧光蛋白融合表达）、蛋白互作（BiFC、FRET、pulldown、Co-IP等）、蛋白-核酸互作（ChIP、RIP等）、酶活验证或候选酶筛选、代谢工程、基因功能验证（VIGS、RNAi）等等。尽管这项极其实用的技术从方法步骤上看出人意料的简单（protocol在最后），然而在实际应用中效果却也不总是那么稳定和出众，不少同学都曾多多少少遇到过蛋白表达量忽高忽低、叶片难以注射、细胞之间感染不均匀等奇怪的问题。

烟草叶片瞬时表达系统高度依赖农杆菌识别、侵染植物细胞并转移T-DNA这一生物学过程，因此，正确准备植物双元载体和操作农杆菌是核心议题之一。在深度解析质粒图谱这一篇文章中已经讲过，能够在农杆菌中自主复制的质粒必须包含农杆菌兼容的复制起始位点，一般来说大小10 kb以上的双元载体都具备这个特征。然而pGreen系列载体单独转化农杆菌时是无法自主复制的，必须共转化pSoup助质粒。

农杆菌的固体和液体培养基中都必须正确、足量的添加抗生素，以GV3101菌种为例，一般同时使用50 mg/L利福平（抗性基因位于基因组DNA，可有效抑制非农杆菌的增殖）、50 mg/L庆大霉素（抗性基因位于菌种自带的质粒中，缺少此质粒的农杆菌将失去侵染植物的能力），以及双元载体抗性基因对应的抗生素，例如50 mg/L卡那霉素等。为了确保不同批次之间转化效率始终稳定和高效，对于间隔时间较长（两周以上）的两次实验，每次都应该从保存的甘油菌中重新划线并挑取单菌落进行后续实验。严格禁止反复继代小摇的菌种。如果你对你的甘油菌种的纯度和活力有信心，直接刮取少量甘油菌进行小摇也不是不可以。对于绝大多数的应用例如蛋白亚细胞定位，在15毫升试管中培养3毫升就足够使用了。不要过度培养，即便是从甘油菌直接培养，24小时也足够了。

烟草叶片瞬转既可以使用本氏烟草（Nicotiana benthamiana）也可以使用烟草（Nicotiana tabacum）。烟草叶片的生长状态对外源基因的表达水平以及侵染的细胞一致性起决定性的作用，以本氏烟草为例，烟草瞬转不一定非要使用刚从种子萌发的幼苗，但一定优先选择幼嫩的叶片。即使使用已经开花很久的年老植株，只要选择正确的幼嫩叶片，外源蛋白表达量依旧能够达到惊人的水平。在培养烟草时注意以下几点，可以大大增加表达量、或者降低注射的阻力。不要过度施肥，特别是氮肥不能过量。又大又厚、叶色浓绿、摸起来非常坚韧厚实、位于整个植株中下部的叶片尽管看起来显得非常健康，实际上这些叶片是最不适合瞬转的叶片，外源蛋白的表达量极低。光照强度宜低不宜高（PAR小于50 μmol·m^-2·s^-1），特别的，光质上蓝光的比例不能过高，推荐使用偏暖一些（色温不超过5000 K）的日光灯培养。尽管蓝光被认为有促进气孔张开的作用，但是长期光照过强或者蓝光的比例过高，很容易使得叶肉细胞之间长得过于紧密，叶片角质化程度严重，从而使得农杆菌很难渗透。比较理想的材料应当是位于植物上部，还在活跃生长的幼嫩叶片，叶色嫩绿，尚没有夸张的表皮毛生长，表面光泽较弱，表明还没有过多角质层的积累，触感薄而柔软，且较为平整，没有很厚的叶脉生长。这样的叶片，叶肉细胞之间的间隙非常大，农杆菌溶液非常容易渗透；细胞活力高，几乎每个细胞都能被侵染且以相似的水平表达蛋白；软而薄的叶片也能非常容易制作平整的显微镜样品，这样在显微镜下能够很容易地找到平坦的视野，让所有细胞都能位于焦点之内。

农杆菌侵染后，不同载体骨架的最佳采样时间需要自己摸索，即便同一个载体不同融合蛋白的表达量峰值出现的时间也可能不一样。如果以亚细胞定位为目标，通常含有35S启动子的载体表达球蛋白在注射一天半后就可以尝试制片拍照，注射后2~3天可以认为是峰值，5天内都可以反复拍照，但是许多困难的膜蛋白相比球蛋白需要更长时间才能积累到满意的水平。一般来说，共转化P19基因时表达量峰值出现的时间还要进一步推迟一天以上，但是持续的时间会更长。如果需要检测的对象不是蛋白而是更加下游的效应，比如酶的产物，往往需要等待的时间要比蛋白表达更长一些，但都需要根据具体情况进行预实验确证。如果是没什么经验的新手或者最近遇到一些不稳定的情况，建议使用简单方便的可视化标记来监视农杆菌的侵染、基因的表达，并验证体系运作的情况，例如RUBY系统可以产生明显的红色色素甜菜红素作为侵染表达成功的标记，如果手边有方便使用的荧光显微镜或者荧光成像设备，可以使用荧光蛋白来摸索表达量最大的时间。

幸福的家庭都是相似的，不幸的家庭各有各的不幸。

列夫·托尔斯泰

托尔斯泰的话虽然总结的是婚姻和家庭，然而用来描述实验也是极其恰当的。当烟草瞬转顺利的时候，不论何时做、是谁在做，结果都是相似的好；然而当瞬转效果不好的时候，可能的问题却是千差万别，下面我举一个近期实验室出现的实例。实验室某博士生最近一直在重复亚细胞定位的实验，最开始的时候，虽然也并不是视野中的每一个细胞都有很好的荧光信号，但是总归还能找出信号比较强的细胞，拍出来的效果也还不错。可是随着不断地重复，侵染的概率越来越低，信号越来越弱，直到有一天，信号弱到已经分不清是背景荧光还是真实信号，所以为了让图片显得亮一些，用了很高的PMT增益，画面信噪比极差，完全不可用于发表。当我去检查实验的各个环节，发现烟草苗的状态并不差，表达的时间也够，侵染的OD也很适合，甚至连共转的亚细胞区室的质粒表达也很正常，但是就是目的基因表达极弱，侵染概率极低，很大一片区域只有一两个稍微有点亮的细胞。最后我询问了农杆菌摇菌的抗性，本来应该是利福平、庆大霉素和壮观霉素，但是学生自己也不知道从什么时候开始，就变成了利福平、庆大霉素和卡那霉素。这就完美了解释了为什么亚细胞标记的质粒（卡那抗性）表达正常但是目的基因（壮观霉素）不正常。其实在农杆菌培养的过程已经出现了异常的现象，学生觉得农杆菌摇起来的时间比以前长了很久，但是并没有引起足够的重视。

详细的瞬转方法如下（小量，适合亚细胞定位等）：

1. 新鲜转化农杆菌，或者从甘油菌划线，28℃倒置平板培养两天。
2. 挑取一个大小适中、饱满的单菌落至3毫升LB培养基中（包含所有抗性），28℃振摇培养最长不超过24小时。接种的当天，给烟草充分浇水，确保第二天气孔可以充分张开，利于注射。

3. 12000g室温离心1分钟收集菌体，尽量吸去上清。用1毫升10 mM氯化镁溶液充分悬起沉淀，颠倒洗涤菌体。利福平对植物细胞有副作用需要尽量洗去。侵染缓冲液的配方五花八门，但实际上只有氯化镁没有什么问题，越简单的溶液配方可重复性越是高。

4. 离心收集菌体，尽量吸去上清。用1毫升10 mM氯化镁溶液充分悬起沉淀，添加乙酰丁香酮至终浓度200 μM，室温静置2小时，诱导农杆菌Vir基因表达。

5. 颠倒混匀菌体，取20微升稀释至1毫升，用分光光度计测OD600，计算出1毫升菌悬液的浓度。一般来说，过夜菌的OD在2~3之间，将3毫升农杆菌浓缩至1毫升，终浓度应该在6~10。

6. 用含有200 μM乙酰丁香酮的10 mM氯化镁溶液将浓缩菌液稀释成工作液，如果需要共转多个质粒，确保携带每种质粒的农杆菌有效浓度都为0.4~1.0（具体多少合适需要预实验确定）。举例，假如1毫升浓缩菌液的OD为8，需要配制2毫升终OD为0.8的工作液，则吸取0.2毫升的浓缩液，加入1.8毫升的氯化镁即可。如果需要共转5个质粒，每种菌液吸取0.2毫升，再加入1毫升氯化镁即可，此时的菌液总OD高达4。

7. 选择合适的叶片，用1毫升规格的平头注射器吸取工作液，从叶片的下表皮缓慢注射直至渗透的面积符合需求。操作时，用一只手的中指指腹隔着叶片抵住注射器，确保力度足够密封但不至于将叶片戳破。新手请佩戴护目镜或者面罩，防止农杆菌喷溅入眼睛。如果实在难以注射，可以用注射器针头轻轻划几下制造一些小伤口，或者扎一个小孔，扎穿透都是可以的。

8. 正常培养注射后的植株即可，无需刻意避光。在合适的时间之后，收集材料进行后续实验。