【原】HuR KSRP

Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR. 

Isabel López de Silanes, Ming Zhan, Ashish Lal, Xiaoling Yang, Myriam Gorospe

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004 Mar 02;101(9):2987-92 doi:10.1073/pnas.0306453101

PMID:14981256

HuR是一种与特定mRNA亚群结合的蛋白质，越来越被认为是基因表达的关键转录后调控因子。在这里，HuR在保留HuR-RNA相互作用的条件下免疫沉淀，并通过cDNA阵列杂交鉴定HuR结合的靶mrna。通过对HuR靶标之间共享的一级序列和二级结构的分析，发现了一个富含尿嘧啶的17-20碱基长的RNA基序。这种HuR基元几乎存在于之前报道的所有HuR靶点的mrna中，优先位于所有检测的单基因转录本的3'非翻译区域内，并且在>50%的人类和小鼠同源基因的中保守。重要的是，HuR基序允许从基因数据库中成功预测和随后验证新的HuR靶点。本研究描述了一个HuR靶标RNA基序，并提出了识别RNA结合蛋白靶标基序的一般策略。

HuR对KSRP起拮抗作用，通常含有分离的Gs，但很少含有Cs

The sequence selectivity of KSRP explains its flexibility in the recognition of the RNA targets. 

María Flor García-Mayoral, Irene Díaz-Moreno, David Hollingworth, Andres Ramos

Nucleic acids research 2008 Sep;36(16):5290-6 doi:10.1093/nar/gkn509

PMID:18684992

k-同源（KH）剪接调节蛋白（KSRP）是一种多结构域RNA结合蛋白，它调控mRNA代谢的不同步骤，从mRNA剪接到mRNA衰减，与广泛的RNA序列相互作用。为了了解KSRP如何识别其不同的RNA靶标，有必要定义KSRP-RNA相互作用的一般规则。我们在这里描述了一个完整的支架独立分析KSRP的四个KH结构域的rna结合潜力。分析表明，KH3与RNA的亲和力明显高于其他结构域，并特异性识别富G靶点。这也证明了KSRP的其他KH结构域显示出不同的序列偏好，这解释了蛋白质识别的广泛靶标。此外，KSRP对包含几个相邻C的序列表现出很强的负选择性，限制了KSRP在单链RNA区域内的靶标选择。通过对KSRP KH结构域的RNA结合潜力的深入分析，我们可以了解低序列特异性结构域在多结构域RNA结合蛋白识别RNA中的作用。

为了验证我们的SIA数据的排序，并将它们与实际亲和(8)联系起来，我们测量了不同域和SIA所示的一组具有代表性的首选序列之间形成的配合物的解离常数（表1）。我们还测量了序列u CCCC的RNA寡核苷酸的结构域的亲和力，根据SIA，该寡核苷酸被所有四个KSRP结构域选择。这些结合分析的结果（图3）证实了SIA数据，并提供了四个结构域的rna结合能力的清晰图像。我们之前曾报道过KH3与Kd为100 mM的富auRNA序列结合，比KH2和KH4强3倍，而KH1与相同序列的结合亲和力很低(7)（I.Dı'az-Moreno等人，已提交发表）。我们现在发现，KH3与sia定义的序列（uGGGU）的结合比与典型的UAUUAU或UAUUUA元素的结合强100倍（图3a）。相比之下，KH2对SIA序列（uUUAG）的结合亲和力与上述富au元素的结合亲和力相似（在错误范围内）。KH4与首选SIA序列（uAGGG）的结合仅比与富au元素的结合强（2倍）。最后，KH1与富au元素的结合很弱，但能有效地区分有利于SIA靶点（uUGGG）（图3a）。这与上面描述的SIA数据一致，该数据表明该域在目标的任何位置上都不有利于A。此外，它还表明，KH1以低亲和力与RNA靶标结合，但有效地区分了想要的序列，这种组合可能有助于探索大RNA靶标内的结合空间。我们的结合数据也证实了这四个单独的结构域对富c序列有很强的选择，因为在核磁共振滴定过程中没有观察到可测量的位移（图4a）。为了评估这种负选择性在四结构域蛋白中的影响，我们使用一个包含所有四个结构域（KH1234）和两个rna的结构域测试了KSRP-RNA相互作用：一个polyC 25-mer和TNF-a ARE 25-mer。CD和EMSA表明，虽然与ARE序列的结合非常紧密[Kd在低摩尔范围(7)]，但与polyC的相互作用很弱（Kd>>mM）（数据未显示），这证实了KSRP的KH域也选择了四域蛋白中多个相邻的Cs。值得一提的是，我们结合分析中使用的寡核苷酸既有6-mer（TNF-a衍生），也有5-mer（sia衍生）。原则上，第六个核苷酸可能参与了与蛋白质的额外重要接触。然而，我们没有看到6-mer相对于5-mer的额外化学位移变化，这表明可能发生类似的接触范围。事实上，当将uGGGU和uAGGG 5-mers分别滴定为KH3和KH4时，以及用富au的6-mers滴定时，观察到最大数量的位移。此外，sia衍生的特异性5-mers比TNF-a衍生的6-mers以更高的亲和力结合KH结构域，因此任何由于第六个核苷酸而可能的差异都会增加本文报道的特异性和非特异性序列之间的差距。如前所述，观察到的富c五聚体的阴性特异性已经通过RNA 25-mers进行了验证。我们之前已经证明，KH3对AUrich序列的亲和力高于KH2或KH4对相同序列的亲和力。我们在这里表明，该结构域能够识别具有微摩尔Kds的富g序列。这种亲和力相当于分离的Nova-1 KH3对含有其目标序列的短RNA5-mer(8)，表明KSRP KH3对特异性和非特异性RNA序列的区分效率超过100倍。综上所述，KH1、KH2和KH4与Kds >100 mM的首选ssRNA序列结合，而KH3与特定靶点复合物的Kd为1-2mM。这表明，在含有G-rich序列的靶标中，KH3定义了整个KSRP的识别框架。最近的一项发现验证了这一通用模型，即KH3结合将KSRP连接到含有GG的Let7a miRNA前体的顶端环上，并刺激pri（和前）-miRNA加工（M.特拉布奇等人，提交发表）。然而，在KSRP的ARE靶点中，3-G延伸是罕见的：蛋白质结合的富au序列必须是单链构象，插入三个连续的g可能有利于与其他30-UTR序列进行碱基配对。因此，我们想知道KSRP对G-rich序列的识别是否主要与其与非are靶点的相互作用有关。SIA数据报告了靶标一个位置的核苷酸偏好，并且在很大程度上与序列上下文不耦合。因此，我们可以预期，在富au元素中插入分离的Gs（或GG元素）将稳定有利于KH3结合的特定复合物。在富au环境中，单个Gs并不促进稳定的二级结构元素的形成，而且确实在KSRP的许多are靶点中都有发现。我们检测了KH3对ARE序列中嵌入的单和双G基序的结合亲和力。

KH3-UAGUAU和UAGGUU复合物的Kds分别为26+-5和6+-2mM（图4b）。在TNF-a ARE衍生的富AU序列中插入一个独立的G，导致KH3亲和力增加5倍；插入第二个G导致亲和力进一步增加4倍。这清楚地表明，KH3可以在富AU环境中识别单G和双G，这种识别可能是KSRP RNA靶标的普遍特征。

KSRP通过多个结构域（4,7）的联合作用识别其RNA靶标，KH1、KH2和KH4在RNA结合中的区分作用是微妙的，但不一定不如KH3重要。KSRP的两个或三个KH结构域的组合，包括KH3，是在纳米范围内达到Kd的必要条件，但KSRP的KH结构域对一系列序列表现出很强的负选择性，这些序列中包含多个C的序列。3'-UTR内的PolyC mRNA区域预计是单链的，就像富AU的一样，并被多KH调控蛋白如hnRNP K和其他PolyC结合蛋白靶向。Cs的负选择性限制了KSRP与可能的ssRNA靶标子集的结合，并有助于识别的特异性。需要重点指出的是，KSRP可以与分散的C序列结合，只有当几个连续C出现时，才适用负选择性。值得一提的是，体外选择的RNA靶点HuR，一种含有RRM的ARE结合蛋白，对KSRP起拮抗作用，通常含有独立的Gs，但很少含有Cs（14）。

非序列特异性RNA结合域的作用是多结构域蛋白RNA识别中一个长期存在的问题。有人提出，一些多结构域RNA结合蛋白，如hnRNP K，使用序列特异性和非序列特异性结构域的组合来选择它们的RNA靶点（15,16）。我们的数据显示，KSRP还使用高特异性和低特异性域的组合来识别靶标，如果存在G-rich序列，KH3将在定义靶标RNA的结合框架中起主导作用。然而，RNA的功能结合需要进一步的相互作用，考虑其他结构域在区分靶标RNA和非靶标RNA时的负选择性影响是很有趣的。随着对ssrna结合蛋白的序列偏好进行更深入的分析，#负选择性 可能被认为是防止不必要的蛋白质-rna相互作用的有效答案。