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保乳手术的术中冷冻切片分析（frozen section analysis，FSA）对临床意义重大，对病理医师和病理技术员的要求较高。由于保乳手术乳腺切缘数量多，且脂肪组织不易冷冻，而前哨淋巴结周围的脂肪组织难以剔除干净以及存在内部脂肪化等问题，给冷冻制片带来一定的难度。因此，该共识是在大量临床实践的基础上，总结出关于保乳标本乳腺切缘及前哨淋巴结冷冻制片的技术要点和切片方法，旨在为病理技术员提供更全面且有价值的技术指导及规范化操作，从而获得高质量的冷冻切片。随着人们对早期乳腺癌生物学特点的深入研究，以及早期乳腺癌诊断技术的不断改进和综合治疗技术的广泛运用，使早期乳腺癌保乳手术的安全性和有效性不断提高。保乳手术作为早期乳腺癌的外科治疗手段之一，为患者提供个性化治疗方案越来越受到重视。保乳手术已成为早期乳腺癌的标准治疗方式[1]。保乳手术的切缘一直是乳腺外科和乳腺病理领域的重要话题[2]，因为保乳手术成功率的重点在于肿瘤是否被完整切除，即乳腺切缘应为阴性，切缘阳性对同侧乳腺局部复发有显著影响，也是决定患者二次手术率的重要因素[3-5]。目前可实施切缘评估的方法中，冷冻病理切片具有更好的时效性及可操作性，可在术中对切缘状态进行评估，了解病变组织切除情况，分析手术是否成功[6]。各个机构都有其评估切缘的实际操作方法，一般情况下，保乳标本切除后，手术医师用银针或缝线按前、后、左、右、表面、基底立体方位做六点标记，然后涂染料送病理检查，这要求保乳标本有多个切缘需要制片。前哨淋巴结的术中冷冻切片检查是乳腺癌患者腋窝淋巴结状态有效且可靠的预测指标[7-8]。每一例保乳标本往往也有多颗前哨淋巴结需要制片。因此，保乳标本乳腺切缘及前哨淋巴结需要制片的数量多，且切缘多为脂肪组织，淋巴结周围多带有脂肪组织或存在内部脂肪化等，不易冷冻，导致冷冻制片质量参差不齐甚至难以制片。术中冷冻切片分析（frozen section analysis，FSA）对病理医师和病理技术员的要求较高，需要经过特殊训练。为保证术中FSA的时效性，同时为病理技术员在较短时间内完成多个切缘及淋巴结的制片并保证切片的完整性提供全面而有价值的技术细节指导，促进保乳标本乳腺切缘及前哨淋巴结冷冻制片的规范化操作，病理技术四大学组（中国医师协会医学技师委员会病理技术专家组、中国医学装备协会病理装备分会标准化部、中国研究型医院学会病理学专业委员会病理技术学组、中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会病理技术学组）在大量临床实践的基础上，联合国内相关领域的专家多次研讨修正，制定本共识。 1.1 取材 临床送检的保乳标本必须保持新鲜、标记清晰，取材前不能使用氯化钠注射液、固定液或其它液体浸泡组织；如果取材时标本用水冲洗，组织表面需用纸或纱布吸干；取材器械和取材台面要保持洁净，避免造成标本污染。取材病理医师应根据临床送检保乳标本的实际情况及临床要求，在条件允许范围内规范化取材，所取切缘组织不宜过大、过厚，亦不宜过小、过薄，较理想的组织长度和宽度为0.5-1.0 cm，厚度为0.2 - 0.3 cm。切缘组织过大、过厚的不良影响：（1）容易出现假阴性；（2）不利于快速冷冻；（3）不利于获得完整、平整的切片。切缘组织过小、过薄的不良影响：（1）厚切时组织容易被切光，不利于完整制片；（2）容易出现假阴性。 1.2 切片温度 （1）组织四周加适量包埋剂（包埋剂滴加在组织四周，少量、均匀分布即可，无需将组织完全埋在包埋剂中），浸入液氮快速冷冻。若所取切缘组织较小或较薄时，可根据组织大小先用少量包埋剂制作一个空白冰托，将组织放在冰托上，再如上进行包埋。（2）粗修至暴露所需的组织面并记住此时夹头的方向。一般为所取组织的最大面，如果遇到离肿块比较近的切缘需少修，若取材医师有特殊要求可深修。（3）粗修后的组织再次浸入液氮中，冷冻到组织表面发硬（在液氮中冷冻3～4 s）。如冷冻时间过久，切片时组织和包埋剂将会成粉末状难以完整切片；如冷冻时间不够，切片时组织面仍呈软湿状态难以完整切片。1.2.2 使用冷冻辅助设备（以Milestone冷冻包埋仪为例）
（1）涂一点包埋剂在玻璃转移板的尖端，组织需要切的一面朝下放在玻璃转移板上，然后将组织移入冷冻模具里。（2）将模具用包埋剂填满，冷冻头平面朝下置于模具上。（3）加上取出器，盖上盖子，根据组织大小冷冻15～60ｓ。（1）提前设置冷冻切片机机箱温度（CT）和冷冻头温度（OT）值，一般冷冻切片机可设置最低温度约为－35℃。（2）组织四周加适量包埋剂（包埋剂滴加在组织四周，少量、均匀即可，无需将组织完全埋在包埋剂中），置于速冻台上快速冷冻。若所取切缘组织较小或较薄时，可根据组织大小先用包埋剂制作一个空白冰托，然后将组织放在冰托上，再如上进行包埋。（3）待最外周包埋剂凝固时，用冷冻锤平行轻压于组织块上，若无冷冻锤可将组织块倒扣于速冻台上。 （4）粗修至暴露所需的组织面并记住此时夹头的方向。一般为所取组织最大面，如遇到离肿块比较近的切缘需少修，或取材医师有特殊要求时可深修。 （5）将组织面朝下置于速冻台上，充分冷冻到组织表面发硬。 1.3 切片厚度 切片厚度（15～30 μｍ），以能切出完整的切片为准。 1.4 切片速度 （1）无防卷板：保持夹头方向与粗修时一致，快速单张切片，直到切出完整的切片（如果此时切片边缘的包埋剂发生卷曲，可用毛笔轻轻摊开）。 （2）利用防卷板：保持防卷板及底座清洁，调整好刀片和防卷板的位置，使防卷板在刀锋前约0.1ｍｍ并保持平行，使切片能平整地进入防卷板与切片刀之间的缝隙。保持夹头方向与粗修时一致，将粗修后组织四周多余的包埋剂切除，快速单张切片，直到切出完整的切片。 1.5 贴片 提前准备好正确标号的玻片，在切出完整的切片后，快速贴片，防止脂肪组织软化粘在板上而导致切片不能完整贴到玻片上。 1.6 固定及染色 贴片后需及时且充分固定（推荐在甲醇固定液中固定约1 min，固定液需每天更换以保证新鲜和足量），随后放入全自动染色机按冷冻染色程序染色。如果是手工染色，在水洗和脱水等过程中需注意动作轻柔，避免因外力作用导致脂肪组织脱落，从而影响切片的完整性。所有染液需每天更换以保证浓度及足量，染色前先用试染切片试染，并根据染色结果调整染色时间。特别注意在季节交替等原因导致环境温度发生改变时，应做好切片染色的质量控制。 （1）临床送检的前哨淋巴结组织必须保持新鲜，取材前不能使用氯化钠注射液、固定液或其它液体浸泡组织，如取材时用水冲洗，组织表面需用纸或纱布吸干。取材器械和取材台面要保持洁净，避免造成标本污染。取材医师用带手套的手指触摸找到较脂肪组织硬的淋巴结组织，尽可能完整剔除其表面的脂肪组织，可配合使用吸水纸或干净纱布，轻轻挤压去除表面的部分脂肪组织。（2）较厚的淋巴结沿最大面，按约2 ｍｍ的间隔剖开取材。（3）由于不同淋巴结的转移情况存在差异，需要切片的深度可能不一样，因此以一个冷冻头放置一颗淋巴结为最佳。（4）若一个冷冻头上需放置多颗淋巴结时，将大小及厚度相近的淋巴结并列放置于同一个冷冻头，每个冷冻头上最多不超过 3 颗淋巴结。如需将大小不等的淋巴结置于同一冷冻头上，可先在放置较小者的一侧底部垫一点包埋剂，使所放淋巴结保持在同一高度。（5）如遇需要关注是否有前哨淋巴结周围组织侵犯时，取材需要保留一些附带的脂肪组织，不可强行剔除。组织四周加适量包埋剂（包埋剂滴加在组织四周，少量、均匀即可，无需将组织完全埋在包埋剂中），浸入液氮或置于速冻台快速冷冻，待四周包埋剂冷冻完成后使用冷冻锤轻压在组织表面，可使组织和周围的包埋剂更平整且冷冻更迅速，可有效减少冰晶的产生。如果没有冷冻锤，可将冷冻头组织面朝下倒置于冷冻台上继续冷冻。设置冷冻切片机机箱温（CT）－20～－25℃，冷冻头温（OT）－15～－20℃。由于工作量不同，冷冻切片机机箱内实际温度与温控温度存在差异；冷冻切片机品牌不同、设计不同、性能不同，设定的温度存在差异；同时组织大小不同适合的温度也不同，因此需要根据实际情况将设定温度略作调整。温度过低易导致淋巴结组织发脆，组织切片在镜下呈裂隙状；温度过高易导致淋巴结组织发软，切片时组织皱缩，不易获得平整无皱褶的切片。切片厚度5～6 μｍ为宜，切片过薄（＜5 μｍ）细胞不易着色，切片过厚（＞6 μｍ）易产生裂隙，且镜下细胞重叠不利于诊断。（1）选择组织周围包埋剂较多的位置朝下（作为最先切到位置），借助毛笔牵引切片。切片时注意用力要轻柔、均匀，避免因转速不稳导致切片厚薄不均或产生褶皱。（2）使用防卷板切片时，可将组织下缘以下的包埋剂全部切掉后再切片，可使组织直接进入防卷板与刀锋的缝隙中，有效减少褶皱。2.5.2 “靠岸型”淋巴结（即淋巴结四周仅局部位置脂肪组织剔除干净）（1）选择淋巴结四周没有脂肪组织的位置朝下（作为“锚定点”位置），再借助毛笔牵引切片。切片时注意用力要轻柔、均匀，避免因转速不稳导致切片厚薄不均或产生褶皱。（2）使用防卷板切片时，将组织下缘以下的包埋剂全部切掉，并尽可能将淋巴结周围脂肪组织及包埋剂去掉后再切片，可使组织直接进入防卷板与刀锋的缝隙中，有效减少褶皱（图1）。
图1 使用防卷板切淋巴结：A．粗修后淋巴结组织周围仍有少量脂肪；B．将淋巴结组织下缘以下的包埋剂全部切掉，将淋巴结周围脂肪及包埋剂尽可能去除后再切片 2.5.3 “孤岛型”淋巴结（即淋巴结周围脂肪组织均未剔除干净） （1）二次包埋法更适合粗修后周围脂肪组织较多而淋巴结组织较小且多颗时（图２）：①组织周围加适量包埋剂后冷冻，粗修至所需的组织切面。②将冷冻头拿到冷冻切片机外复温，待包埋剂稍变软后，用尖头镊子将淋巴结轻轻取出放在吸水纸或干净纱布上，仔细去掉周围多余的脂肪组织，再将淋巴结重新放置于冷冻头上进行第二次包埋。③借助毛笔或防卷板切片（切片方法参见周围脂肪组织剔除干净的实性淋巴结）。 （2）“搭桥”法更适合粗修后周围脂肪较多且为单颗较小淋巴结时（图３）：①组织周围加适量包埋剂后冷冻，粗修至所需的组织切面。 ②将脂肪量较多的一端朝下作为“锚定点”，使用削尖的铅笔头轻轻插入该处脂肪中，将脂肪组织挤出后用纱布轻轻擦去，左右轻轻晃动铅笔，使四周轻轻探出一个“口大底小”的口袋状小凹槽，为后续的包埋剂填充留出适宜空间（注意铅笔接近淋巴结边缘时要由远及近，即由边缘脂肪组织向淋巴结组织方向划动，越靠近淋巴结动作越轻柔，避免伤及淋巴结被膜）。 ③保持样本夹头固定在原位，将包埋剂挤入凹槽中，并在凹槽及其周围反复涂抹几次，确保有足量的包埋剂进入凹槽中。然后快速用冷冻锤轻压，可进一步将凹槽中的包埋剂深入推进并快速冷冻成型。 ④轻轻修掉表面包埋剂，注意此时的修片动作不宜过快，进刀幅度不宜过大，边修边观察，越接近目标切面越“轻、缓、稳”。 ⑤修出所需的完整切面后，借助毛笔或防卷板切片。 
图2 二次包埋法切淋巴结：A．粗修后淋巴结组织周围脂肪较多且为多颗较小淋巴结；B．将冷冻头复温，包埋剂稍变软后，用尖头镊子将淋巴结轻轻取出，去除其周围多余的脂肪，将淋巴结重新包埋后再切片 图3 “搭桥”法切淋巴结：A．粗修后淋巴结组织周围脂肪较多且为单颗较小淋巴结；B．将脂肪量较多的一端朝下，使用铅笔尖轻轻插入将脂肪组织挤出形成小凹槽，将足量包埋剂推入小凹槽作为“锚定点”，将淋巴结表面轻修平整后再切片 2.5.4 内部脂肪化的淋巴结 （1）内部脂肪化但四周仍有较多实性组织的淋巴结：可参考“靠岸型”淋巴结操作。 （2）内部脂肪化且四周均是脂肪组织的淋巴结：可参考“孤岛型”淋巴结操作。 2.6 固定及染色
2.6.1 固定 由于淋巴结组织的冷冻切片中细胞丰富密集，淋巴细胞易收缩，细胞核染色较深，因此选择合适的固定液（既能快速固定，又有良好的固定效果）对淋巴结冷冻切片的HE染色质量有较大影响。贴片完成后应立即放入固定液中充分固定，切忌切片干燥后再固定，若不及时充分固定易造成细胞退变，细胞核模糊不清，组织原有结构丧失而影响诊断。在环境温度高或空气干燥的情况下，室温越高，细胞退变速度越快[9]。推荐使用固定液： （1）甲醇，冷冻固定速度快，细胞收缩小，对细胞核和抗原的保存较好。 （2）AAF液（95％乙醇85 ｍＬ＋40％甲醛10ｍＬ＋冰醋酸5 ｍＬ），兼有１０％中性福尔马林和95％乙醇的作用，冰醋酸能抵消乙醇引起的细胞收缩，对抗原保存较好。 2.6.2 染色 切片充分固定后，依次进行水洗（2～5ｓ）→ 苏木精染色（1～4 ｍｉｎ）→水洗（10ｓ）→蓝化（2ｓ）→水洗（30ｓ）→伊红染色（2～10ｓ）→梯度乙醇（75％乙醇，2ｓ；85％乙醇5ｓ；95％乙醇5ｓ；100％乙醇Ⅰ 5ｓ；100％乙醇Ⅱ 5ｓ）脱水→二甲苯（二甲苯Ⅰ 5ｓ；二甲苯Ⅱ 10ｓ）透明→封固（各试剂的时间不同，实验室可根据实际情况作适当调整）。所有染液需根据切片数量及时更换，以保证其浓度及足量，染色前须先用试染的切片进行试染，并根据试染结果调整染色时间。特别注意在季节交替、环境温度发生改变时，需做好切片染色的质量控制。 2.7 前哨淋巴结切片产生冰晶的补救措施 规范取材的前哨淋巴结，由于没有及时快速冷冻，造成切片镜下冰晶严重而影响诊断时，可通过重新快速冷冻的方法来改善：将已经加包埋剂冷冻的组织放到室温环境下复温，直至包埋剂完全融化，淋巴结组织回到取材时的状态（此时如果淋巴结周围有可去除的脂肪可进一步将其剔除干净），重新包埋后及时快速冷冻再切片，可改善部分细胞间的冰晶。 本共识详细阐述组织取材、切片方法、切片技巧及注意事项等，从实际出发，力求简捷、具有可操作性和指导性，为推进保乳标本乳腺切缘及前哨淋巴结冷冻制片的规范化、标准化程度奠定基础。目前本共识仍有一定的局限性，需广大病理技术工作者在实践中不断总结经验、拓展思路，探求更多、更好的方法。参与本版共识的病理技术专家成员（按单位名称汉语拼音字母排序）：安徽医科大学第一附属医院（潘美华）；北京大学医学部病理学系／北京大学第三医院（张燕）；北京大学肿瘤医院（周立新）；重庆市人民医院（刘瑾）；福建省立医院（陈昕）；福建省肿瘤医院（师怡、吴在增）；福建医科大学附属第一医院（李国平）；复旦大学附属华山医院（高名士）；复旦大学附属中山医院（宿杰阿克苏、黄洁）；复旦大学附属肿瘤医院（蔡旭、张静、周学科）；广东省人民医院（骆新兰）；广西医科大学第一附属医院（党裔武）；广西中医药大学第一附属医院（崔锦珠）；海军军医大学附属长海医院（倪灿荣）；哈尔滨医科大学附属肿瘤医院（孟宏学）；航天中心医院（侯芳）；河南省人民医院（孙廷谊）；湖北省肿瘤医院（王明伟）；华中科技大学同济医学院附属协和医院（罗丹菊、翁密霞）；江苏省人民医院（张炜明）；江南大学附属中心医院（汤鸿）；第一附属医院（胡沛臻、钱守斌）；辽宁省肿瘤医院（何莲）；陆军军医大学大坪医院（毛成毅）；南京大学医学院附属鼓楼医院（吴鸿雁、杨军）；宁波临床病理诊断中心（陈洁、俞吉霞）；宁夏医科大学总医院（秦瞡、李国富）；青岛大学口腔医学院（赵洁）；陕西省宝鸡市中心医院（徐燕）；陕西省肿瘤医院（王晓敏）；上海交通大学附属新华医院（虞文伟）；上海交通大学附属瑞金医院（许海敏）；上海中医药大学附属岳阳医院（冼志红）；首都医科大学附属北京世纪坛医院（高颖）；四川大学华西医院（雷松、陈敏）；苏州大学附属第一医院（朱卫东）；山西省肿瘤医院（肖彦增）；天津中心妇产科医院（宋剑婵）；温州医科大学附属第一医院（黄卡特）；西安交通大学第二附属医院（靳耀锋）；新疆石河子大学医学院第一附属医院（郑玉琴）；新疆医科大学第一附属医院（师艺、苗娜）；云南省肿瘤医院（陈芸）；云南省第三人民医院（徐开军）；浙江大学医学院附属第二医院（王海军）；浙江大学医学院附属第一医院（丁伟、姚洪田、徐黎明、邹尹影、杨如菊）；浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院（王炜）；浙江省肿瘤医院（胡锦林、张谷）；郑州大学第一附属医院（高冬玲、黄培、王芸姣）；中国人民解放军总医院第一医学中心（宋欣）；中国人民解放军东部战区总医院（马恒辉、王璇）；中国人民解放军北部战区总医院（秦海明）；中国人民解放军总医院第四医学中心（康佳蕊）；中国医学科学院北京协和医院（王德田、薛晓伟、庞钧译）；中国医学科学院血液病医院（!）；中国医学科学院肿瘤医院（郑波、郭蕾）；中南大学湘雅医院（傅春燕、徐志杰）；中日友好医院（张红雷）；中山大学附属第一医院（梁英杰、董愉）；中山大学肿瘤防治中心（肖永波、卢佳斌）。丁 伟（E-mail：181010@zju.edu.cn）杨如菊（E-mail：yri0205074@163.com）
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