单抗融合步骤

单抗融合步骤：

一、实验必备（以下器材必须全部准备齐全才可以开始操作）：

一）器械：

名称	数量
符合细胞培养要求的超净台	1台
水平离心机	1台
细胞显微镜	1台
血球计数板	1块
灭菌手套	5副以上
灭菌杯子	3只以上
75%酒精消毒的固定板和10ml固定针头	3套以上
1.5ml/15ml/50ml离心管及配套	3套以上
排枪及各种规格移液器	1套以上
灭菌枪头	1套以上
5-10ml注射器	2个
灭菌镊子和剪刀	10把以上
灭菌匀浆器	3套以上
灭菌细胞筛网	3把以上
灭菌玻璃培养皿	5套以上
灭菌滤纸	数张
96/6孔细胞培养板	10块以上

二）试剂：75%乙醇、1640不完全培养基、胎牛血清、5%PEG1450融合剂、双抗（链霉素和青霉素）、HAT、HT、0.4%台朌蓝染色液（PBS）。

三）材料：

①.     已经冲击免疫好的Balb/c小鼠一只（融合前1-3天冲击免疫，可选小鼠尾静脉或腹腔冲击，不加佐剂）用于取免疫脾淋巴细胞。

②.     空白鼠Balb/c一只（用于制备饲养细胞，饲养细胞可以是幼鼠胸腺细胞，但不好取；可以是小鼠脾脏细胞，也可以是腹腔细胞，取脾细胞做饲养细胞最简单）。

③.     SP2/0细胞（获取SP2/0细胞做融合主要有两种方法A. 传代培养的SP2/0细胞：要求生长速度快，大小均匀，无污染，吹打悬浮起即可使用；B.将SP2/0接种到Balb/c小鼠皮下，长出实体瘤，如花生半大小为宜。取实体瘤细胞做融合效果更佳。）

四）试剂配制：

①.     分取PEG1450 1ml于无菌EP管，于37℃预温。

②.     HAT完全培养基：20%胎牛血清+1%双抗(链霉素和青霉素)+1/50体积的HAT（50×）+不完全培养基1640，按每块96孔板20ml配制，于37℃预温。

③.     分取50ml不完全培养基1640 37℃预温（融合后稀释PEG用）。

五）实验前准备工作：实验前将实验要用到的离心管、离心管架、剪子、镊子、匀浆器、细胞筛网、培养皿、固定板等放入超净台，紫外照射30min左右。

二、操作步骤：

A.     饲养细胞的制备（可在融合前一天完成，亦可当天制备）：

1.       取空白Balb/c小鼠，眼球取血处死，将其浸入75%乙醇中5min，并且用镊子将其夹住在乙醇中不时搅动使其充分消毒。

2.       将灭过菌的纸铺在泡沫板上（内面朝上），用镊子将老鼠从75%酒精中取出，沥干酒精，固定在灭菌纸上

3.       取10ml针头将老鼠仰面四脚固定（脚不要拉的太紧）

4.       用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的皮肤，用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子，沿口子将老鼠的皮肤撕开，将其固定（注意：老鼠外侧皮毛不要接触内部）

5.       取10ml不完全培养基1640在干净的灭菌玻璃培养皿里，用10ml注射器取5ml培养基，用一个灭菌镊子轻轻提起老鼠的腹膜，将5ml培养基打入老鼠腹部，同时轻轻按摩老鼠的腹部1分钟后，将培养基回收，置于50ml无菌离心管中，再次吸取5ml培养基，可重复此步骤多次。（此步为取腹腔细胞步骤，如不需则省略）

6.       取3-5ml培养基放入匀浆器中，取干净的剪刀和镊子，将鼠腹腔剖开，取出其左侧的脾脏剪去表面脂肪，放进匀浆器中研磨。

7.       将研磨的液体自通过细胞筛网过滤掉块状物。

8.       取3—5ml左右培养基冲洗匀浆器，再次过筛网。

9.       将经过细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中，若取了腹腔细胞可与之合并置于50ml无菌离心管中，加培养基至30ml，离心1500rpm，5min，弃上清。

10.   用之前配置好的HAT完全培养基重悬沉淀物（即饲养细胞），此时饲养细胞已制备好，可按10⁵/孔使用，于融合前一天铺板10⁵个/100μl/孔，亦可当天随融合细胞混合铺板。

B.      免疫脾细胞制备：

1.        取免疫冲击好的Balb/c小鼠，眼球取血处死，将其浸入75%乙醇中5min，并且用镊子将其夹住在乙醇中不时搅动使其充分消毒。

2.        将灭过菌的纸铺在泡沫板上（内面朝上），用镊子将老鼠从75%酒精中取出，沥干酒精，固定在灭菌纸上

3.        取10ml针头将老鼠仰面四脚固定（脚不要拉的太紧）

4.        用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的皮肤，用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子，沿口子将老鼠的皮肤撕开，将其固定（注意：老鼠外侧皮毛不要接触内部）

5.        取3-5ml培养基放入匀浆器中，取干净的剪刀和镊子，将鼠腹腔剖开，取出其左侧的脾脏剪去表面脂肪，放进匀浆器中研磨。

6.        将研磨的液体自通过细胞筛网过滤掉块状物。

7.        取3—5ml左右培养基冲洗匀浆器，再次过筛网。

8.        将经过细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中，加培养基至30ml离心1500rpm，5min，弃上清。

C.      融合细胞SP2/0制备：

如果SP2/0为培养细胞，直接吹打悬浮起来后离心即可计数使用；

如果为实体瘤SP2/0，按以下步骤操作：

1.       取已长好实体瘤的小鼠，眼球取血处死，将其浸入75%乙醇中5min，并且用镊子将其在乙醇中搅动使其充分消毒。

2.       将灭过菌的纸铺在泡沫板上（内面朝上），用镊子将老鼠从75%酒精中取出，沥干酒精，固定在灭菌纸上

3.       取10ml针头将老鼠俯面四脚固定（脚不要拉的太紧）

4.       用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的皮肤，用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子，沿口子将老鼠的皮肤撕开，将其固定（注意：老鼠外侧皮毛不要接触内部）

5.       用镊子和剪刀剪下实体瘤（实体瘤以均匀棕白色，质地松软不液化为最好，液化部分多为死细胞）放入匀浆器中研磨。

6.       将研磨的液体自通过细胞筛网过滤掉块状物。

7.       取3—5ml左右培养基冲洗匀浆器，再次过筛网。

8.       将经过细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中，加培养基至30ml离心1500rpm，5min，弃上清。

注：以上A、B、C三个步骤可以同时进行，融合时细胞离体时间越短越能提高其融合效果。

D.     融合步骤：

1.       用不完全培养基1640将SP2/0细胞和免疫鼠脾细胞重悬，分别用血球计数板计数，按脾细胞：SP2/0细胞=1:3比例于50ml无菌离心管中混合，充分混合后加1640至40ml。

2.       离心1500rpm，5min ，此时准备37℃左右的温水

3.       离心后弃上清以及管壁液体（可用灭菌纸吸干）轻轻敲打SP2/0和免疫鼠混合离心沉淀使其松动，将离心管底部浸入37℃温水中

4.       培养箱中拿出已温育的1ml融合剂PEG1450，60s内均匀滴入细胞混合沉淀中（边滴加边转动离心管）

5.       静置，温预45s，之后取出37℃温箱中预热的不完全培养基1640，取1ml培养基60s均匀滴入沉淀中（边滴加边转动离心管），再取1ml，30s内均匀滴入，之后将剩余的45ml培养基全部慢慢滴入。注意：不要冲击！（此步骤为稀释融合剂）

6.       轻轻颠倒混匀之后，离心1500rpm，5min  弃上清。

7.       用含有饲养细胞和HAT培养基溶液重悬沉淀（若饲养细胞已提前铺好，则只需用一半的HAT培养基溶液重悬）。

E.      铺板培养：

a)         96孔液体培养：

1.       用排枪将重悬后的液体均匀铺入96细胞培养板，200μl/孔（若饲养细胞已提前铺好，则只需在其中重悬融合细胞没孔加100μl即可）。

2.       置5% CO₂，37℃培养箱培养，培养一周后换液，留一半换一半，用HAT完全培养基。

b)        半固体培养基培养：

1.       取2%甲基纤维半固体培养基（1×不完全培养基1640+1×HAT+1%双抗+20%胎牛血清）20ml，加入20ml融合细胞和饲养细胞悬液[HAT完全培养基]，再加入2ml促进杂交瘤形成添加物因子，充分混匀后，倒入6孔板，3ml/孔。

2.       置5% CO₂，37℃培养箱培养，长出白色集落，挑取白色集落至含饲养细胞的96孔板中。