 导语 今天给同学们分享一篇脂肪酸代谢+预后模型的生信文章“Fatty acids metabolism affects the therapeutic effect of anti-PD-1/PD-L1 in tumor immune microenvironment in clear cell renal cell carcinoma”，这篇文章于2023年5月23日发表在J Transl Med期刊上，影响因子为8.44。  透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾脏恶性肿瘤的一种高度侵袭性和转移性亚型，与适应包括浸润免疫细胞和免疫调节分子的肿瘤微环境的代谢重编程有关。免疫细胞在肿瘤微环境（TME）中的作用及其与ccRCC中异常脂肪酸代谢的关系仍知之甚少。 1. 预测模型的构建 本研究共纳入309个与脂肪酸代谢相关的基因。经过TCGA数据集过滤、质量评估和数据处理，最终通过“limma”R包提取出96个DEG，结果表明62个DEG下调，34个DEG上调。热图和火山图用于可视化DEG（图1b，c）。预后模型是基于单变量和多变量Cox回归分析以及LASSO分析开发的（图1d，e）。最终，预后模型通过森林图可视化（图1f），由20个基因组成：HACD1、HPGD、ALOX15B、ABCD1、HMGCS2、CPT1B、TDO2、SCD5、PCCA、DPEP1、ALAD、ACADM、ACADSB、ACAT1、PLA2G4A、ALOX12B、IL4I1、ACAD11、HIBCH、LTC4S。风险评分 = （0.319240 * HACD1） + （− 0.084391 * HPGD） + （− 0.180228 * ALOX15B） + （0.459381 * ABCD1） + （− 0.063391 * HMGCS2） + （0.325758 * CPT1B） + （0.140669） * TDO2） + （− 0.029671 * SCD5） + （0.127550 * PCCA） + （− 0.067707 * DPEP1） + （− 0.342020 * ALAD） + （− 0.040588 * ACADM） + （2007年1月31日） * ACADSB） + （− 0.110134 * ACAT1） + （− 0.161595 * PLA2G4A） + （− 0.407284 * ALOX12B） + （0.280250 * IL4I1） + （− 0.028668 * ACAD11） + （− 0.158444 * HIBCH） + （− 0.766512 * LTC4S）。  图1 预测模型的研究设计和构建综述 2. 预测模型验证 ROC曲线和KM曲线用于探索预后模型在内部和外部验证集上的预测能力。在3年、5年和7年的ROC曲线下面积（AUC）中发现了优异的结果，在TCGA-KIRC列车队列中分别为0.761、0.761和0.752；TCGA-KIRC验证队列中的0.691、0.770和0.733；以及E-MTAB-1980队列中的0.693、0.725和0.766（图2a–c）。训练和验证队列中AUCs大于0.68的结果表明，作者的模型具有高灵敏度和特异性，可以准确、稳健地预测ccRCC患者的预后。 使用相同的预后模型，作者根据所有风险评分的中位数将所有验证集中的剩余患者分为不同的风险组。TCGA-KIRC训练和验证以及E-MTAB-1980队列中预后模型的风险评分是总生存率（OS）的独立保护因素。与低危组相比，高危组患者的OS明显降低（P < 0.05，图2d，e）。K-M分析进一步显示，在TCGA-KIRC队列中，具有高风险评分的ccRCC患者的无进展生存期（PFS）较低（P < 0.05）。  图2 预测模型的预测准确性 3. TCGA-KIRC队列的临床病理特征 如图6所示，进行了临床相关性分析，表明分级和分期水平随着预后模型的风险评分而增加（P < 0.05，图3a）。此外，风险评分显示出优越的预测能力，与年龄、性别、级别和阶段相比，ROC曲线下的面积最大（图3b）。此外，TCGA-KIRC总队列中3年、5年和7年的AUC值分别为0.745、0.765和0.742（图3c）。随后，根据临床特征和风险评分，进行了OS预测的列线图，并将年龄、分期和风险评分作为独立的预后因素（P < 0.05）（见图3d）。在校准图中（图3e），ccRCC个体的1年、3年和5年OS对该个性化列线图模型具有良好的预测性能（C指数 = 0.779）。  图3 临床特征、新列线图及免疫学特征 4. 预后模型的免疫景观和对抗PD-1/PD-L1治疗的反应 基于免疫相关队列（CheckMate 025研究的Nivolumab组、IMmotion150的Atezolizumab组和IMmotion151队列的Atezulizumab加贝伐单抗组）检查对抗PD-1/PD-L1治疗的反应，结果表明，进展性疾病（PD）组与完全缓解组（CR）组和部分缓解组（PR）组具有统计学显著性差异。毫不奇怪，来自免疫相关数据库的结果显示，高危人群对抗PD-1/PD-L1治疗的反应明显较低（图第3f段）。此外，通过TIDE算法，TCGA-KIRC数据库中的高危人群具有较高的免疫逃逸潜力，免疫治疗效果较差（图3g）。应用估计算法，作者计算了免疫评分的总体水平。高危组的免疫评分高于低危组（图3h）。此外，正如预期的那样，在IMmotion150和IMmotion151队列中，生存的低风险组与更高的PFS相关（P < 0.05，图3i）。然后，作者对CheckMate-025研究进行了分层K-M分析。结果表明，在CheckMate-025队列中接受尼武单抗单药治疗的ccRCC患者中，不同风险组之间的生存率存在显著差异，而接受依维莫司（mTOR抑制剂的哺乳动物靶点）治疗的患者则没有显著差异，表明作者的模型更有效，更适合于ccRCC患者的抗PD-1/PD-L1治疗。随后，在几种免疫特征的比较中，发现高风险组的炎症促进、T细胞共刺激、检查点、抗原呈递细胞（APC）共刺激、趋化因子受体（CCR）和I型IFN应答高于低风险组，而II型IFN反应明显下调（图第3j段）。此外，三个免疫相关队列（CheckMate 025研究的Nivolumab组、IMmotion150的Atezolizumab组和IMmotion151队列的Atezzolizumab加贝伐单抗组）中TME细胞组成和单个免疫细胞类型的分数用CIBERSORT计算和生成(http://cibersort./)。作者观察到，高风险组的M0巨噬细胞比例高于低风险组（P < 0.05），从而突出了作者模型的风险评分，可以预测对基于ICI的免疫疗法的临床反应。 5. 风险评分和药物敏感性分析 为了预测高危ccRCC患者对靶向治疗的临床反应，作者筛选了治疗ccRCC患者的化疗药物。作者通过“pRRophetic”软件包根据不同的风险组筛选和估计了ccRCC中的化疗药物，并利用IC50值来测量对药物的敏感性（图4a）。高危组的IC50值明显高于低危组，但对药物的敏感性较低（P < 0.05）（图4b）。为了量化个体患者，通过“ggplot”软件包评估了预后模型和靶向药物的风险评分之间的相关性，并确定索拉非尼、埃洛替尼、萨拉卡替尼和克唑替尼与预后模型的风险评分高度相关，提示所构建的模型能够有效预测ccRCC的疗效和对化疗的敏感性，有助于药物筛选指导下精确治疗ccRCC的临床可行性。为了确定有用的治疗意义和有效的脂肪酸代谢靶向治疗的设计，作者通过CCLE和GDSC的药物敏感性数据进一步评估了ccRCC细胞系的风险评分。结果表明，A498的风险评分最高，而BFTC-909的风险评分最低，这意味着与其他细胞系相比，A498中存在更高的恶性肿瘤。Pearson的相关性分析表明，风险评分与C-75（一种脂肪酸合成酶抑制剂）的IC50呈正相关。这些结果表明，较高的风险评分对C-75不太敏感，C-75可能是治疗低风险ccRCC患者的潜在对应化合物。  图4 药物敏感性分析和识别相关途径 6. 识别相关途径和免疫检查点 作者利用ssGSEA来检查相关途径或免疫检查点的风险评分和富集评分之间的相关性，以探索免疫相关的功能过程。作者的研究结果显示，风险评分与JAK-STAT3信号以及主要免疫检查点之间呈正相关（图4c，d）。这意味着ccRCC中的脂肪酸代谢与JAK-STAT3信号传导有关，风险评分水平可以反映抗PD-1/PD-L1治疗的ccRCC患者的治疗效果。 7. 富集分析和GSEA标志可视化 为了证实JAK-STAT3信号传导和脂肪酸代谢在ccRCC进展中的潜在机制，作者对TCGA-KIRC队列进行了GSEA。基于GSEA分析的结果表明，差异表达的靶基因在免疫和代谢相关的功能途径中富集。特别是上调的DEG组，在JAK-STAT3信号传导中富集。同时，在下调的DEG组中观察到脂肪酸代谢（见图4e）。KEGG富集分析是为TCGA-KIRC队列中的致瘤途径富集分析而开发的，该分析证明了与细胞因子-细胞因子-受体相互作用、脂肪酸代谢以及补体和凝血级联有关（图4f）。进行GO分析以进一步探索DEG的潜在生物学过程，并显示大多数免疫反应和相关活性在这些基因中显著富集（图4g）。因此，这些结果表明，脂肪酸代谢可能有助于ccRCC的发展，主要集中在免疫反应上。 8. 联合指标评估和多模型比较 为了证明作者模型的优越性，作者对TCGA-KIRC队列中的几种免疫指标和先前研究的准确性进行了比较。ROC曲线表明，风险评分的AUC显著高于其他指标和其他脂肪酸代谢相关模型，表明作者的模型更准确（图4h）。总体而言，与其他网络模型或指标相比，构建的模型在脂肪酸代谢方面表现出更大的代表性。 9. mRNA表达的验证 为了分析mRNA的表达谱，作者在肿瘤和正常组织以及ccRCC细胞系的风险模型中探索了6个脂肪酸代谢相关基因的表达水平。qPCR结果表明，ABCD1、ALOX12B、ALOX15B、CPT1B、IL4I1的表达水平在肿瘤样本中显著上调，而HACD1的表达在ccRCC组织中较低（图第5a、b段）。作者还在TCGA-KIRC队列中鉴定了这些基因的表达，结果表明显著基因表达相似的趋势。一致地，在ccRCC细胞系中也观察到这六个基因的表达模式（图第5c段）。  图5 mRNA和蛋白质表达水平的预测和验证 10. 沉默IL4I1抑制ccRCC细胞的生长和侵袭 为了阐明IL4I1在体外ccRCC迁移和侵袭中的作用，分别构建了三种特异性靶向IL4I1的siRNA（si-IL4I1-1、si-IL4I2和si-IL4I-3）（图5d）。Transwell分析显示，在IL4I1沉默后，786-O和769-P的迁移和入侵能力受到抑制（图第6a段）。此外，根据上述结果，集落形成测定和伤口愈合表明，沉默IL4I1显著抑制786-O和769-P的增殖（图第6b、c段）。总之，这些结果共同阐明了IL4I1可以促进ccRCC细胞的生长和侵袭。  图6 IL4I1在ccRCC中增殖、迁移和侵袭的验证 11. 沉默IL4I1影响JAK1/STAT3信号通路 基于以上对作者模型的分析，GSEA表明作者的模型与JAK1/STAT3信号通路密切相关（图第5e段）。为了进一步阐明IL4I1对JAK1/STAT3信号通路的影响，评估了蛋白质印迹以测试IL4I1对JAK1/STAT3信号通路功能结果的贡献。结果表明，沉默IL4I1降低了磷酸化JAK1和磷酸化STAT3的表达（图5f），表明IL4I1可以调节JAK1/STAT3信号通路并导致JAK1/STAT3磷酸化。 12. 沉默IL4I1抑制M2样巨噬细胞极化 为了研究IL4I1向CCL2的信号传导是否可以介导巨噬细胞极化，在si-IL4I1转染的786-O和769-P以及M0样巨噬细胞之间进行了间接共培养条件。流式细胞术结果显示，沉默IL4I1抑制M2样巨噬细胞极化（图7b，c）。此外，蛋白质印迹还表明，沉默IL4I1可以抑制CD206（M2巨噬细胞表面标记物）的水平（图7d），甚至抑制si-IL4I1转染的ccRCC细胞（786-O和769-P）的CCL2表达（图5f）。此外，IHC染色验证了肿瘤样品中IL4I1和CD206的高表达同时高于邻近正常组织中的高表达（图第7a段）。总之，这些结果证明了在si-IL4I1转染的786-O和769-P中敲低IL4I1抑制了由CCL2的调节参与的M2样巨噬细胞极化。  图7 免疫组织化学和共培养试验 总结 本研究表明，脂肪酸代谢影响与JAK1/STAT3信号通路和CCL2相关的免疫细胞的选择性极化，进一步影响PD-1/PD-L1对TME中ccRCC的治疗效果。 |
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