骆驼科产生由 2 条重链和 2 条轻链组成的常规抗体,这些抗体与 Y 形的二硫化物键结合在一起。然而,它们也产生免疫球蛋白G的独特亚类,也称为重链IgG(hcIgG)。 这些抗体仅由两条没有CH1区域的重链和在其N末端的抗原结合域(称为VHH)组成。 hcIgG的独特之处在于其单体抗原结合区(VHH)能够结合具有特异性、亲和力,尤其是多样性的抗原,与传统抗体相当,而无需与其他区域配对。使用分子工程可以产生VHH碎屑。 为什么要使用Covalab VHH片段? 结合隐藏的表位: 它们的空间位阻减少,使它们能够到达传统抗体无法获得的难以获得的抗原,例如酶的活性位点(有助于抑制酶活性)以及较小的酶,例如溶菌酶或核糖核酸酶。 更好的渗透性: 与传统抗体相比,它们穿透组织的能力增强,在进行免疫组织化学时可以更精确地对组织切片进行染色。 更稳定: VHH区域的高再折叠能力使它们在热力学上更加稳定,并能抵抗高温(高达70°C / 158°F)和极端pH值,如胃酸。 1-骆驼免疫接种 免疫: 根据Covalab的 88 天方案,免疫步骤包括 4 次注射和 2 次测试出血。 监测: 免疫反应性通过为该项目开发的检测方法进行监测。 2-噬菌体文库构建 PBMCs分离和RNA提取: 从最终出血中分离外周血单核细胞(PBMC)并提取总RNA。 cDNA合成和VHH扩增: RT-PCR 和 VHH 抗体片段扩增 特异性引物设计用于在VHH编码区域内进行逆转录,第二次嵌套PCR允许cDNA扩增。 噬菌体载体克隆: VHH编码基因被整合到噬菌体载体中,然后用于转化感受态细菌以产生噬菌体文库。 3-平移 目标交互: 将抗原固定在微量滴定板孔的底部,将噬菌体制剂加载到孔中,使其通过在其表面表达的VHH结合抗原。 放大: 洗掉未结合的噬菌体后,剩余的噬菌体被转导成感受态细菌进行富集和扩增。 选择: 在每个淘选阶段结束时,分离编码抗原特异性VHH的cDNA 4- 生产和净化 表达载体中的亚克隆: 插入片段被整合到表达载体中,然后用于转化感受态细菌。 培养、裂解和亲和色谱纯化: 通过亲和色谱从培养物上清液中纯化特异性VHH。 所有编码特定VHH的cDNA都保存在我们的实验室中。 |
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