双光子显微镜

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结合了【激光扫描共聚焦显微镜】和【双光子激发技术】的一种新技术。
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【照明光源】是【红外线】
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根据【爱因斯坦的光子理论】，
【光子能量和波长成反比】，
【光子的波长越长】【能量越小】，
因而【红外光子】就具有【较小的能量】。
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【荧光】
是自然界常见的一种【发光现象】，
是【光子】与【分子】的相互作用产生的。
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根据【雅布隆斯基分子能级图】
大多数在【常态下的分子】是处于【基态】的【S0】
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当受到【光能】【电能】【化学能】等能量激发后，
【原子核周围】的【电子】
从【基态 S0】跃迁到较高的【激发态】,
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【激发态】的【电子】处于【高能量状态】不稳定，
会通过两种途径【释放能量】回到【基态】：
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一种是通过【非辐射跃迁】的方式，
快速地降落到【最低键能能级】，
随后由【低键能能级】
回到【基态】，
以【光子辐射】的形式释放能量。
这就是【荧光产生的过程】。
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【荧光显微镜】
都是用【一个能量较高的光子】去【激发电子】产生【荧光】
发出一个【能量较低】的也就是【波长较长】的光。
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而【双光子激发的原理】
是在【高光子密度】的情况之下，
用两个【波长长的】【低能量光子】同时激发【荧光分子】，
然后发射出一个【波长较短】的【高能量的光子】。
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其效果和【使用一个】【波长】为【长波长一半】的光子
去激发【荧光分子】是相同的。
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这种技术就叫做【双光子激发技术】。
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【双光子激发】需要【很高的光子密度】，
因此【双光子显微镜】使用的是
【高能量锁模脉冲激光器】。
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这种【激光器的特点】是，
发出的激光具有
很高的【峰值能量】，
和【很低的平均能量】。
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因此，
在【满足要求】的同时还不损伤细胞。
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这种激光器在配合使用【高数值孔径的物镜】时，
就能够实现在【物镜的焦点处】的【光子密度】是最高的。
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【双光子的激发】只发生在【样品的一个点上】
如【单光子激发】激发的是【一个激发光柱】，
而【双光子显微镜】激发形成的只有【一个光点】。
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这样使得【双光子显微镜】是不需要【共聚焦针孔】的，
可以大大提高【荧光检测的效率】。
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因此，
【双光子显微镜】有很多优点：
1，【波长长】受散射的影响较小【容易穿透样本】。
2，【焦平面外的荧光分子】不被激发，使【激发光】穿透更深的标本。
3，【长波长】的【近红外光】对【细胞毒性小】。
4，只有在【焦平面上】才有【光漂泊】和【光毒性】。
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因此【双光子显微镜】更适合用来观察
【厚标本】【活细胞】【在体深层组织成像】
以及用来进行【定点光漂白】实验等。
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在观察比较厚的切片时，
如观察 100微米 的切片时，
【双光子成像】更加清晰，
因此【共聚焦显微镜】能够观察样本的厚度一般 小于100 微米的。
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【在体脑部成像】
可以观察到 1.6毫米深度的【海马区域】的【神经元的形态】及【亚细胞结构】。
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另外，
【双光子显微镜】结合【在体膜片钳】记录【钙成像】和【行为学】等技术
可以检测【活体动物】【特定行为时】【脑内神经元】高分辨的【实时的】
活动情况和功能数据。
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所以，
【双光子显微镜】给我们在观察【活细胞】【活体组织中的生命现象】
带来了【革命性的进步】。