浅析模式生物斑马鱼
在内分泌与代谢性疾病中的应用
赣南医学院第一附属医院
许荣
内容
? 斑马鱼的概况
? 斑马鱼模式生物在内分泌与代谢性疾病中的应用
斑马鱼 小型热带淡水鱼
? Zebrafish (英文 ) ； Daniorerio (拉 丁文 )
? 原产于印度半岛的淡水水域 ， 溪 流、池塘、沼泽、稻田
? 体长 2-5厘米 ，背部有蓝色 条纹
? 自然寿命 >5年
斑马鱼
胚胎期 (3dpf ) 幼鱼 期 (46dpf
)
成鱼 期 (3mpf ) 幼苗 期 (12dpf
)
外观
雄鱼：
体型修长 ， 腹部扁平
体色为柠檬色
雌鱼：
体型丰满 ， 腹部膨大、
银亮 ， 体色银灰
配鱼
隔板 盖板
外缸 内缸
在产卵的前一晚将雄鱼雌鱼（雌雄比例为 1:1~1:2）
放于繁殖缸中，贴好标签，用挡板将雄鱼雌鱼分开，
水量为没过斑马鱼背 2~3cm，第二天早上移除挡板
，倒去部分水（水量为没过鱼背 0.5cm左右），中午
收取胚胎后，标签可以重复贴在培养皿上。在鱼缸一
侧贴上标签用于记录产卵日期。雄鱼产过后 5天可以
再交配，雌鱼产过后 7天可以再交配。
斑马鱼的繁殖
胚胎期 (0—4dpf )
胚胎早期发育
doi: 10.1146/annurev.genet.37.110801.143752
斑马鱼胚胎早期发育过程图
（ a,刚刚进入卵裂期的胚胎， b,椭球形期，外包尚未开始， c,
胚盾阶段， d,尾牙期， e,15 体节期， f,20 体节期， g,囊咽期）
囊泡
胚盾：是指脊椎动物局部卵裂胚胎的胚盘层表面上的未来胚胎形成的起始部位
体节：脊椎动物在胚胎发育的过程中沿身体前后轴形成一定数目的暂时性结构
孵化腺 前脑 中脑
后脑
脊索 脊髓 神经底板
胚胎早期发育
器官发育
Santoriello&Zon, 2012
眼 鳃 心脏 肝脏 肠 精巢 鳔 泄殖孔
卵巢
生物学特性及优势
内分泌系统特异性标记
? 标记甲状腺 Tg（ tg： EGFP）
? 标记脑垂体 Tg(-1.0pomca:GFP)
24hpf
? 胰脏特异性标记的荧光品系
Tg(ins:EGFP)
Tg(ins:mCherry)
? 均为斑马鱼胰岛素启动子序列特异性在胰腺中驱
动胰岛 β细胞持续性表达绿色或者红色荧光蛋白
? 它们从胚胎胰腺发育初期直至成鱼期，都可以特
异性标记胰岛 β细胞，因此被广泛应用于追踪胰
腺器官发生以及胰岛 β细胞发生的全部过程
Dong PD&Pisharath H 2007
内分泌系统特异性标记
大纲
? 模式生物斑马鱼的概况
? 斑马鱼模式生物在内分泌与代谢性疾病中
的应用
糖尿病
糖尿病视网膜病变
垂体 ACTH瘤
甲状腺功能亢进
甲状腺功能减退
甲状腺癌
肥胖
高尿酸血症
构建斑马鱼糖尿病模型
doi: 10.3390/ijms24065195
类型 造模方法 优势 弊端
1型糖
尿病
手术切除法 手术切除胰腺是糖尿病造模最
早 的 方法
很难完全切除胰腺，需要高超的操作技术和精巧的设备，对
斑马鱼的创伤性大，手术后存活率低
药物诱导法 时间框架短、简单易掌握、重
复性好，可以在短时间内诱导
出大量模型
需要多次腹腔注射链脲佐菌素，操作复杂
基因改造诱导 转基因技术可用于构建具有特
定功能的斑马鱼
转基因会破坏基因组中的其他基因，导致其他功能基因的丧
失，纯合子的获得需要很长时间。
基因消融法 可以 使用细菌硝基还原酶
(NTR)/甲硝唑 (MTZ)或
CRISPR/Cas9等基因编辑技
术 有效去除
由于当前技术在遗传方面的不稳定性和不确定性，这种方法
具有局限性
2型糖
尿病
葡萄糖溶液浸泡
法
喂养程序简单，大约十天即可
建立糖尿病模型
高糖溶液中，斑马鱼的游动和鳃功能异常，一些斑马鱼在建
模过程中死亡
高脂食物诱导法 喂养程序简单 这需要很长时间，肥胖往往会导致心血管疾病和内分泌异常
CRISPR/Cas9
基因敲除方法
可以快速获得敲除斑马鱼 面对基因编辑，靶基因脱靶，编辑后存在遗传不稳定性
doi: 10.3390/ijms24065195
? 血糖水平是糖尿病临床诊断常用的指标
? 通过检测空腹、餐后血糖水平及糖化血红蛋白指标
? 斑马鱼成鱼 采集血液 进行测量 血糖值
? 斑马鱼幼鱼体型小，血液量少，无法通过采集血液来测量血糖值，
因此使用匀浆间接法进行测量
构建斑马鱼糖尿病模型
构建斑马鱼糖尿病视网膜病变模型
? CRISPR-Cas9基因敲除转录因子
pdx1。
? pdx1是胰腺和十二指肠同源盒，缺
乏 pdx1导致胰腺发育障碍，出现糖
尿病。观察敲除 pdx1后视网膜改变 。
? pdx1-/-视网膜透明质网络在 血管弓
之间 视盘 分支 增多 ，血管直径增加。
? 以此判断新生血管形成 作为表型 。
doi: 10.2337/db19-0873.
构建斑马鱼垂体 ACTH瘤模型
? 构建垂体促肾上腺皮质激素细胞瘤的斑马鱼模型
靶向腺垂体前黑皮质素（ POMC）谱系， 过表达垂
体肿瘤转化基因（ PTTG / securin）
? 出现明显的肿瘤性垂体细胞。
? Tg:Pomc-Pttg 转基因斑马鱼出现皮质醇增多症、
胰岛素抵抗加重、糖耐量异常、心肌病 和肝脂肪
变性等 垂体 ACTH瘤 表现。
doi: 10.1073/pnas.1018091108
? Tg:Pomc-pttg斑马鱼与 WT相比， 类固醇生成细胞扩增，
后主静脉内的血细胞积聚。
? 葡萄糖耐量试验 Tg:Pomc-pttg与 WT鱼相比 血糖 更高
? 禁食后注射胰岛素后血糖对比
doi: 10.1073/pnas.1018091108
构建斑马鱼垂体 ACTH瘤模型
? Tg:Pomc-pttg鱼心包水肿
? HE染色提示心室肥厚
? 肝切片油红 O染色显示 Tg:Pomc-pttg鱼的肝
脂质积累
doi: 10.1073/pnas.1018091108
构建斑马鱼垂体 ACTH瘤模型
构建斑马鱼甲状腺功能亢进模型
? 可用三碘甲状腺原氨酸（ T3）浸泡法持续 25天（浓度： 1ng/ml） 构建 模型
? 通过体长来判断 T3处理斑马鱼的生长动态
? 1–14dpf 脊索长度 (NL,mm),15–31dpf-标准长度 (SL,mm）
? NL:从上颌前端到脊索后尖测量屈曲前幼 鱼 的脊索长度
? SL:在脊索后端弯曲的鱼类中，从上颌的前端到后颌的后端测量标准长度
doi:10.1210/endocr/bqab101
斑马鱼鳍的分布
斑马鱼 ( ♀/ ♂)鳍的分布：左侧为雌鱼 ,右侧为雄鱼
1.背鳍 2.胸鳍 3.腹鳍 4.臀鳍 5.尾鳍
? 胸鳍的位置： T3处理的鱼在发育过程中鳍无明显旋转，鳍尖向后指。
? 而正常发育的幼鱼胸鳍在第三周（ 5.4-5.8mm）会逐渐旋转到接近水平的位置。
doi:10.1210/endocr/bqab101
构建斑马鱼甲状腺功能亢进模型
? 经 T3处理后腹 鳍缺失；或 只发育单一的腹 鳍。
? 行为偏差：经 T3处理后比对照组的鱼 更加活
跃和焦虑。
? 鱼鳔发育不全：经 T3处理后， 鱼鳔未充盈。
doi:10.1210/endocr/bqab101
构建斑马鱼甲状腺功能亢进模型
加速发育和分化， T3双峰作用，可以增强合成代谢或分解代谢，具体取决于剂量
? 尾鳍腹侧肌 ： 经 T3处理后 早在 3.7mmNL时就观察到第一根肌纤维；这些肌纤维
在 3.8mmNL处清晰可见。在正常发育中，通常发生在 4.4mmSL。
doi: 10.1038/s41598-019-41912-9
构建斑马鱼甲状腺功能亢进模型
构建斑马鱼甲状腺功能减退模型
doi: 10.1016/j.neuro.2019.05.008
? 6-丙基 -2-硫氧嘧啶（ PTU）处理
? morpholino (MO) 基因敲降
? 甲状腺消融术
? 敲低 duox构建 甲状腺功能减退斑马鱼模型。
? 比较 duox敲低和对照组之间的形态差异： duox敲低幼鱼发育延迟（ HTA：头 -
躯干角减小）、 心率减慢。
? 通过 ELISA检测甲状腺激素水平， duox敲低幼鱼 T4和 T3水平降低 。
doi:10.1210/endocr/bqab101
构建斑马鱼甲状腺功能减退模型
? 通过 Q-PCR和原位杂交测定 TSH和 TG： duox敲低幼鱼 TSH和 TG的 mRNA表达增加。
doi:10.1210/endocr/bqab101
构建斑马鱼甲状腺功能减退模型
? 突变斑马鱼表现出甲状腺功能减退的表型，包括生长迟缓、甲状腺肿和不孕。
? 通过比较不同时期的体长判断生长迟缓，与 WT相比， duox敲低 斑马鱼体长较 WT短，
体重较轻，且随着斑马鱼的发育，差异越来越明显。
doi:10.1210/endocr/bqab101
构建斑马鱼甲状腺功能减退模型
? 下颌下区域显示出外部甲状
腺肿样生长。
? HE染色显示甲状腺滤泡比
WT更多且更大。
doi:10.1210/endocr/bqab101
构建斑马鱼甲状腺功能减退模型
构建斑马鱼甲状腺癌模型
? 通过导入 BRAF致癌基因，以 构建甲状腺癌转基因鱼 (tg-BRAFV600E-TOM)。
doi: 10.7554/eLife.20728
? 正常斑马鱼甲状腺滤泡形态良好
? 而 tg-BRAFV600E-TOM斑马鱼甲状腺滤泡
形态异常，形成杂乱无章的甲状腺细胞簇。
? 活体成像具有高度渗透性。
doi: 10.7554/eLife.20728
构建斑马鱼甲状腺癌模型
? 抗 T4抗体显色提示， tg-TOM斑马鱼沿腹侧中轴平均形成甲状腺 T4滤泡。
? 相比之下， 转基因鱼甲状腺 T4滤泡 形态改变，大小 和数量均 显著减少。
doi: 10.7554/eLife.20728
构建斑马鱼甲状腺癌模型
? 甲状腺细胞侵入骨骼肌、 鳃组织，在腹颌骨中入侵皮下脂肪。
? 甲状腺状癌的多种特异性细胞学特征：包括无核沟、细长的细胞核，结缔组织增生
性基质反应、拥挤的细胞核。
doi: 10.7554/eLife.20728
构建斑马鱼甲状腺癌模型
tg-TOM tg-BRAFV600E-TOM tg-BRAFV600E-TOM tg-BRAFV600E-TOM
构建斑马鱼肥胖模型
doi: 10.3389/fcell.2018.00091
?构建模型：高脂饮食
转基因系
突变系
? 高脂饮食诱导：最常见的是鸡蛋黄溶液 从 5 dpf开始过度 喂食
或者喂食高脂饲料进行肥胖模型构建
doi: 10.3389/fcell.2018.00091
? 肥胖的主要特征是脂肪细胞肥大和增生。
? 中性脂滴首先出现在内脏脂肪细胞中，并随着斑马鱼的生长而积累。
? 量化斑马鱼肥胖的方法
①3D 显微 CT 分析、横截面图像
黄色为内脏脂肪组织，橙色为皮下脂肪细胞组织
②常用的亲脂性染料：尼罗红、油红 O 和苏丹黑 B
③甘油三酯血水平和肝脂肪变
构建斑马鱼肥胖模型
构建斑马鱼高尿酸血症模型
doi: 10.3389/fnut.2022.1054294
?构建模型：通过黄嘌呤钠盐浸泡法构建高尿酸血症斑马鱼模型
doi: 10.3389/fnut.2022.1054294
?黄嘌呤氧化酶（ XOD）是产生 UA的关键酶。
?测定 UA、血尿素氮（ BUN）、肌酐（ CRE）以
及 XOD的含量在 HUA斑马鱼模型均升高。
构建斑马鱼高尿酸血症模型
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