【原】图解内皮细胞 | 第2期. 成管实验-内皮细胞功能验证需要你！

上一期，我们一起学习了如何解析文献中的内皮细胞成管实验图，并且讲到了成管实验常用的对于成管长度（tube length）的绝对值或相对值的统计（图解内皮细胞 | 第1期. 内皮细胞你原来可以在成管实验中被认证身份），也收到很多小伙伴的反馈，不明白为什么内皮细胞要做成管实验，今天我们就来一起深入学习下吧！

为什么要做成管实验？

在体外实验中，如果我们想要证明内皮细胞的功能特性，发现将内皮细胞培养在重组的基膜细胞外基质(比如BME、Matrigel基质胶、EHS基质等)上，包含多种促生长因子（不同基质胶生长因子浓度不同），来模拟体内状态。内皮细胞在促生长因子的作用下，发挥其“主观能动性”，会迅速形成毛细血管样结构。形成毛细血管样结构的过程中就涉及到血管形成的几个过程，包括内皮细胞粘附、迁移、排列、蛋白酶分泌和小管形成，因此形成的毛细血管样结构能一定程度反映内皮细胞的成血管能力，是目前最广泛使用和最可靠的方法之一。成管实验具备以下优势：

1）对内皮细胞广泛适用性

内皮祖细胞、转化/永生的内皮细胞（bEnd.3 小鼠脑微血管内皮细胞、EA.hy926人脐静脉融合细胞、HUVEC人脐静脉内皮细胞）、原代内皮细胞均能观察到成管结构。

2）血管结构快速形成

内皮细胞将在铺在基质胶后的2-4小时内开始形成小管结构，形成的峰值可能发生在3-12小时之间（需要根据实际细胞类型和操作来确定哦~）。管形成持续18-24小时，之后发生细胞凋亡并且管网络解体。

3）可量化

可以统计branch points/tube length等实现高通量分析体现内皮细胞成管能力。

备注：BME是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出来的可溶性基底膜，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等组成，还包含生长因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、组织纤溶酶原激活物和EHS肿瘤自身含有的其他生长因子。在37℃条件下，液体的基底膜提取物会形成凝集固化成为基底膜层。Matrigel基质胶、EHS基质原理类似。

成管实验能证明什么？

1)研究血管生成和抗血管生成因子

2)定义血管生成的机制和途径

3)定义内皮细胞群

接下来，我们从具体的实例中进一步学习吧！

我们再看另外一篇文献中，同时统计了内皮细胞成管过程中的branch points与tube length。

当然还可以将内皮细胞用钙黄蛋白（AM）处理，使内皮细胞带荧光标记便于观察统计。如下图所示，利用 Image J与血管生成插件软件将用钙黄蛋白AM染色的成管原图（图A），最为直观地展现成管实验的不同统计方法，统计成管节点（D# of nodes红色），管长度（E# of Meshes粉红色），成管网络（F# of Meshes蓝色）。图B-C为merge图，以检测总成管节点(红色)/管(粉红色)/网络(蓝色)与实际成管的合成，此三种统计方法均能体现内皮细胞的成管能力。可以根据自己的需求选择合适的分析方法哦~