【原】基因递送系统｜第2期. 如何获得高滴度的慢病毒？

我们通常所说的慢病毒属于逆转录病毒科，是RNA病毒中的一类。其两端是长末端重复序列（LTR），我们的目的基因即处于两个LTR之间，病毒感染后进入宿主细胞，RNA经逆转录酶合成双链DNA，双链DNA被整合酶整合至宿主细胞基因组上，可随宿主细胞分裂传递给子代细胞。LTRs之间插入的目的基因序列就被整合到宿主基因组中，从而实现外源基因在宿主细胞中的表达，见图一。那么如何才能获得高滴度的病毒呢？

前边我们给大家介绍过慢病毒载体的发展历程，要想包装出一个完整的病毒，我们需要一个穿梭质粒：这个质粒两端LTR区域携带有我们目的基因，但它是复制缺陷型的。还需要辅助质粒：一个包膜质粒；一个或两个包装质粒（第二代包装系统需要一个包装质粒，第三代包装系统需要二个包装质粒）。

今天，我们以一个10cm dish，慢病毒三质粒体系为例，将慢病毒具体包装流程分析如下：

Day 1：

种板HEK 293T细胞（细胞传代最好30代以内），以1:3～1:5传代（即一皿均分成3～5皿）。

Day 2：

在细胞密度长到约70～80%汇合时（通常在种板20-24小时内即可达到），进行三质粒转染。本次采用PMD2g：PxpAx2：PLVX(载有目的基因的质粒)=1:1.5:2，即2ug: 3ug: 4ug，该比例可调整。转染试剂用PEI (质粒：PEI=1:2~1:4)。

将三个质粒共计9ug添加到含500ul的DMEM基础培养基中，无血清无双抗，混合均匀，标记为complex 1，将含27ug的PEI溶液加入DMEM基础培养基中，无血清无双抗，混合均匀，标记为complex 2。将complex 2滴加到complex 1中，混合均匀，静置15-30分钟。滴加入细胞中。

Day 3：

转染后8h-12h换液，将含有转染试剂的HEK 293T上清更换为8mL～10mL 含5%血清的DMEM培养基。

Day 4：

在转染后的48-72h，为病毒生产的高峰期，一般我们收集转染后48h（换液后36-40h，产毒36-40h）的病毒液用于实验，足以满足大部分实验需求。收集病毒上清于15mL tube中，离心去细胞碎片和杂质，随后使用注射器和滤器进行过滤。收集后的病毒上清可以用来进行病毒滴度测定和储存。如果病毒不能一次用完，建议分装到-80度保存。避免反复冻融。