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题目：MdHB7-like positively modulates apple salt tolerance by promoting autophagic activity and Na+ efflux 刊名：The Plant Journal 作者：Fengwang Ma, Ke Mao et al. 单位：Northwest A&F University, Yangling 日期：20 July 2023    01 摘要  盐胁迫对作物的产量和质量产生不利影响，并限制了作物的地理分布。研究关键基因在盐胁迫反应中的功能和调控机制，对于培育具有增强抗逆性的作物具有重要意义。 自噬在调节植物对各种非生物胁迫的耐受性方面发挥着重要作用。然而，盐诱导自噬的机制在很大程度上是未知的。阳离子/Ca2+交换蛋白通过抑制Na+积累来增强苹果的耐盐性，但对盐胁迫反应的机制尚不清楚。在这里，我们发现自噬相关基因MdATG18a调节苹果的耐盐性。 在盐胁迫下，MdATG18a过表达转基因植物的自噬活性、脯氨酸含量和抗氧化酶活性高于对照植物，Na+积累低于对照植物。在盐处理过程中使用自噬抑制剂表明MdATG18a的调节功能依赖于自噬。酵母单杂交分析显示同源结构域亮氨酸拉链（HD-Zip）转录因子MdHB7样直接与MdATG18a启动子结合。转录调控和遗传分析表明，MdHB7样通过促进MdATG18a的表达增强了盐诱导的自噬活性。 转基因酵母Na+流出速率分析表明，MdCCX1的表达显著促进了Na+的流出。启动子结合、转录调控和遗传分析表明，MdHB7样通过直接促进MdCCX1的表达来促进Na+流出和苹果耐盐性，这与自噬途径无关。总的来说，我们的发现通过MdHB7-like-MdATG18a和MdHB7-like-MdCCX1模块深入了解了苹果中MdHB7样介导的耐盐性的机制。这些结果将有助于未来对植物胁迫诱导自噬和胁迫耐受调节机制的研究。 02 技术路线  Two MdATG18a-overexpressing lines (OE#3 and OE#11), the two MdHB7-like-overexpressing lines (OE#1 and OE#3), and the two MdHB7-like-RNAi lines (RNAi#1 and RNAi#3) of transgenic apple plants ('GL-3’ background) were obtained in previous studies Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis Vector construction and genetic transformation of calli Measurement of physiological parameters and histochemical staining Transient transformation of apple leaves and the NaCl treatment Measurement of physiological parameters and histochemical staining Dual luciferase assay、Western blot assays Yeast-one-hybrid (Y1H) assays 03 主要结果 3.1 MdATG18a的过表达增强了苹果植株的耐盐性 在之前的一项研究中，我们发现MdATG18a在苹果植物的叶子和根中表达最强烈。为了研究MdATG18a对盐胁迫的反应，分析了在NaCl处理下MdATG8a在叶片和根系中的表达模式。NaCl处理显著诱导了MdATG18a的表达，其在根中的3小时和在叶中的9小时迅速达到峰值（图1a，b）。 为了进一步验证盐胁迫对MdATG18a转录的影响，克隆了MdATG8a启动子并用于驱动gusA基因的表达。GUS染色和活性测量表明，NaCl处理显著增强了MdATG18a启动子的转录活性（图1c，d）。
图1 MdATG18a的表达是由盐胁迫诱导的。 （a，b）响应于NaCl处理的根（a）和叶（b）中MdATG18a的相对表达水平。在水培条件下（25°C，连续白光）用200mM NaCl处理生根的GL-3植物。在指定时间点采集的样本用于qRT-PCR分析。 （c）proMdATG18a:GUS转基因苹果愈伤组织的GUS染色。 （d） GUS活性的测定。 为了鉴定MdATG18a在盐耐受性调节中的作用，在水培系统中用120mM NaCl处理野生型（WT；GL-3）和MdATG8a过表达（OE#3和OE#11）转基因苹果植物20天。在正常条件下，WT和OE品系之间没有观察到生长差异。在NaCl处理下，野生型植物的叶片比MdATG18a-OE系的叶片出现更多的棕色斑点，表明野生型植物经历了更多的胁迫相关损伤（图2a）。应激相关生理指标的测量，如相对电解质渗漏（REL）、丙二醛（MDA）和总叶绿素含量，也与观察到的表型差异一致（图2b–d）。 为了进一步比较盐胁迫对这些植物的损害，测定了苹果叶片PSII的最大光化学效率（Fv/Fm）和净光合速率（Pn）。正如预期的那样，NaCl处理降低了苹果植株所有品系的Fv/Fm和Pn水平，OE品系的下降幅度明显低于WT（图2e–g）。 这些结果表明，MdATG18a在苹果耐盐性中起着积极作用。高盐度会导致Na+的过度积累，从而导致细胞损伤。脯氨酸作为渗透保护剂发挥着关键作用，被认为是抗应激的指标。对苹果叶片中脯氨酸和Na+含量的测量表明，在盐胁迫下，OE系的脯氨酸含量显著高于WT，而Na+含量显著低于WT（图2h，i）。这些结果表明，在盐胁迫下，过表达MdATG18a促进了脯氨酸的积累，抑制了Na+的过度积累，增强了苹果植株的耐盐性。
图2 过量表达MdATG18a可增强苹果的耐盐性。 （a） 在120mM NaCl处理20天后WT和MdATG18a-OE转基因苹果植物的表型。在正常条件下生长的植物被用作对照组。 （b–d）处理后WT和转基因植物叶片中的电解质渗漏（b）、MDA含量（c）和总叶绿素含量（d）。 （e） 叶绿素荧光图像。 （f） Fv/Fm比率。 （g） 净光合作用（Pn）。 （h–i）野生型和转基因植物叶片中的脯氨酸（h）和Na+含量（i）。 3.2 过表达MdATG18a促进盐胁迫下苹果叶片ROS清除和自噬活性 盐胁迫导致ROS的过度积累，从而在植物细胞中诱导氧化损伤。本文采用DAB和NBT组织化学染色分别检测了H2O2和O2在苹果叶片中的原位积累。在正常条件下，H2O2或O2的积累没有观察到显著差异。盐胁迫处理后，野生型植物叶片上的棕色（DAB染色的H2O2）或蓝色斑块（NBT染色的H2O2）比转基因系上的更强烈，这表明OE系中ROS的积累低于野生型植物（图3a，b）。H2O2和O2含量的测量进一步证实了组织化学染色结果（图3c，d）。抗氧化酶，如过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），对清除ROS至关重要。然而，在WT和MdATG18a转基因植物之间没有检测到这些酶的活性的显著差异。在盐胁迫下，这些酶的活性增加，并且在盐处理后，OE系的增加幅度大于WT植物（图3e–g）。这些数据表明，在盐胁迫下，过度按压MdATG18a通过促进抗氧化酶活性来促进过量ROS的清除。盐胁迫会迅速诱导自噬，这有助于保护生物体免受逆境的影响。 MdATG18a的表达是由各种非生物应激源诱导的，如干旱和高温，它们增强了苹果植物的自噬活性。为了确定不同基因型在盐胁迫下的自噬活性是否发生变化，通过透射电子显微镜（TEM）观察了苹果叶片中自噬体的形成，以监测自噬活性。在正常条件下，在WT和OE植物中观察到少量的自噬体结构和自噬体。在盐处理下，野生型和OE植物中的自噬体数量增加，但OE系中的自吞噬体数量显著高于野生型植物（图3h，i），表明过表达MdATG18a促进了对盐胁迫的自噬。
图3 ROS的积累、抗氧化酶活性以及自噬体在苹果叶片中的形成。 （a，b）分别通过DAB和NBT组织化学染色检测H2O2和O2的原位积累。 （c，d）苹果叶片中H2O2（c）和O2（d）的含量。 （e–g）过氧化物酶（POD）（e）、过氧化氢酶（CAT）（f）和超氧化物歧化酶（SOD）（g）的活性。 （h） WT和MdATG18a-OE转基因植物叶肉细胞自噬结构的代表性TEM图像。自噬体用箭头表示。 （i） WT和MdATG18a-OE植物叶片中的相对自噬活性。 3.3 在盐胁迫下，MdATG18a过表达减少了盐诱导的损伤并增加了根系的自噬活性 根是最先受到盐胁迫影响的器官。因此，评估了盐胁迫对WT和MdATG18a OE植物根系的影响。盐处理下各品系根系的生长和活力均显著低于正常条件下。此外，与野生型植物相比，OE系中盐胁迫的抑制作用部分减轻，因为OE系表现出比野生型植物更具活力的白色根系和更高的根系活力（图4a，b）。 此外，盐处理大大增强了Na+在根中的积累，但OE系中的Na+含量显著低于WT植物（图4c）。这些结果表明，在盐胁迫下，过表达MdATG18a减少了盐诱导的苹果根系损伤和过量的Na+积累。还测量了根中的自噬活性。与叶子类似，在正常条件下，在任何植物的根中都很少观察到自噬体；然而，在盐胁迫下，OE系的根细胞中有更多的自噬体结构，自噬活性高于WT植物（图4d，e）。这些发现表明，自噬是由盐胁迫在苹果根中触发的，并且在OE系中比在WT系中更强烈。
图4 在盐胁迫下，苹果中过表达MdATG18a可导致根系更好的生长和更高的自噬活性。 （a） WT和MdATG18a-OE转基因植物处理后的根系表型。 （b，c）WT和MdATG18a-OE转基因植物根部的根系活力（b）和Na+含量（c）。 （d） 根细胞中自噬结构的代表性TEM图像。自噬体用箭头表示。 （e） 根细胞的相对自噬活性。 3.4 MdATG18a在苹果耐盐性中的积极作用依赖于自噬 ATG基因的过表达增加了胁迫条件下的自噬活性，从而增强了植物的胁迫耐受性。获得MdATG18a-HA转基因苹果愈伤组织，以确定过表达MdATG8a所赋予的耐盐表型是否依赖于自噬（图S1a），并在盐处理试验中使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA），其通过抑制III类PtdIns3K来阻断自噬体的形成，以降低自噬活性。用150mM NaCl处理15天后，生长表型和鲜重的比较表明，过表达MdATG18a显著提高了转基因愈伤组织的耐盐性。然而，在盐胁迫下，添加3-MA消除了WT和MdATG18a HA转基因愈伤组织之间的生长差异（图5a，b）。为了进一步证实3-MA对自噬活性的影响，使用荧光探针单丹酰尸胺（MDC）标记自噬体，并在荧光显微镜下观察和计数标记的斑点。NaCl处理显著诱导了WT和MdATG18a HA愈伤组织中自噬体的形成，并且转基因愈伤组织的自噬活性显著高于WT愈伤组织（图5c，d）。添加3-MA显著抑制了盐诱导的自噬活性的增加，这导致WT和MdATG18a HA转基因愈伤组织的自噬活动保持在低且相似的水平（图5c，d）。这些结果表明MdATG18a介导的盐耐受依赖于自噬。
图5 自噬是MdATG18a介导的苹果耐盐性所必需的。 （a） 对照条件下苹果愈伤组织的生长表型和含或不含3-MA的NaCl处理。 （b） 愈伤组织的鲜重。 （c） MDC染色的愈伤组织自噬体的荧光观察。MDC染色的自噬体显示在绿色点状。 （d） MDC染色的自噬体的定量。 3.5 MdHB7样直接与MdATG18a启动子结合并促进其转录 为了探索盐诱导MdATG18a表达和自噬活性的机制，克隆了MdATG8a启动子序列，并用Y1H法筛选了苹果cDNA文库。筛选结果显示，MdHB7-like，一种正向调节苹果耐盐性的HD-Zip I蛋白，与酵母中的MdATG18a启动子结合（图6a）。进行电泳迁移率转移测定（EMSA）以进一步验证MdHB7-like与MdATG18a启动子的直接结合。序列分析显示，在MdATG18a启动子中有两个假定的结合位点（图6b；图S2）。EMSA结果显示，MdHB7样直接与启动子的P1位点结合，在添加突变体和竞争探针后，EMSA验证了结合特异性（图6c）。 为了在体内进一步验证这种结合关系，构建MdHB7样MYC过表达载体并转化到苹果愈伤组织中。然后用100mM NaCl处理MdHB7样MYC转基因和WT愈伤组织12小时，用于染色质免疫沉淀（ChIP）测定。ChIP-qPCR分析结果表明，MdHB7样结合到体内MdATG18a启动子中的P1位点（图6d）。 为了阐明MdHB7-样对MdATG18a的转录调控作用，在盐处理后测定了MdATG8a在WT和MdHB7-样Myc转基因愈伤组织中的表达水平。MdATG18a在转基因愈伤组织中的表达显著高于野生型愈伤组织，表明MdHB7样转录激活MdATG18a（图6e）。 双荧光素酶系统用于进一步研究MdHB7样对MdATG18a启动子的转录调控作用。将MdATG18a启动子克隆到pGreenII 0800-LUC报告载体中，并将MdHB7样CDS插入pGreenII 62-SK效应载体中（图6f）。这些构建体在具有特定组合的烟叶中瞬时表达。荧光观察和相对LUC/REN活性测量表明，MdATG18a启动子的转录活性在正常条件下较低，但可以通过NaCl处理诱导（图6g，h）。当MdHB7样蛋白共表达时，MdATG18a启动子的转录活性显著增加，特别是在NaCl处理下（图6g，h）。这些结果表明，MdHB7-like直接与MdATG18a启动子结合，并响应盐胁迫上调其表达。
图6。MdHB7样在NaCl胁迫下直接促进MdATG18a的表达。 （a） Y1H测定显示MdHB7样在MdATG18a启动子上的结合能力。 （b） EMSA显示MdHB7-like直接与MdATG18a前体结合。MdATG18a启动子中的假定结合位点在示意图中用红色字母（P1，P2）标记。 （c） 在添加突变体（Mut）和竞争性（Cold probe）探针后，通过EMSA鉴定MdHB7样与MdATG18a启动子中的位点P1的结合特异性。这些探针的序列可以在表S1中找到。 （d） ChIP-qPCR分析表明MdHB7-like在体内与MdATG18a启动子结合。 （e） NaCl处理后野生型和转基因愈伤组织中MdATG18a的相对表达。 （f） 结构化报告载体和效应载体的示意图。 （g，h）双LUC测定中的荧光观察（g）和相对LUC/REN活性测量（h）。 3.6 盐胁迫下MdHB7样过表达诱导的自噬活性增加依赖于MdATG18a 基于MdHB7样对MdATG18a表达的调节作用，我们推测MdHB7-样可能通过增加自噬活性来增强苹果的耐盐性。MdATG18a的表达在MdHB7-OE植物中显著上调，但在MdHB7-RNAi植物中下调，特别是在盐胁迫下（图7a）。接下来，我们检测了WT和MdHB7（RNAi#1和OE#3）转基因植物叶片中的自噬活性。在盐胁迫下，MdHB7样OE#3系的自噬活性显著高于野生型植物，但MdHB7-样RNAi#1系的自吞噬活性显著低于野生型植物（图7b，c）。因此，MdHB7样在盐胁迫下正调节自噬活性。 为了确定MdHB7样在调节自噬活性中的功能是否依赖于MdATG18a，使用MdHB7-RNAi#1、MdHB7-OE#3和GL-3植物的叶片作为土壤杆菌EHA105介导的瞬时转化的背景材料。获得了MdHB7样和MdATG18a表达上调或下调的几种类型的双转基因叶片（图S3）。在共表达和NaCl处理3天后，对叶片进行取样以进行自噬体的TEM观察。结果表明，MdHB7样RNAi+对照载体（GFP-HA）转基因叶片的自噬活性较低；然而，MdHB7样RNAi+MdATG18a HA转基因叶片的自噬活性很高，与空载体（RNAi）+MdATG18a HA转染叶片的自吞噬活性相似（图7d，e）。此外，MdHB7-OE+MdATG18a RNAi转基因叶片的自噬活性较低，与对照载体（GFP-Myc）+MdATTG18a RNAi转基因叶相似（图7f，g）。这些结果表明，MdATG18a在调节盐诱导的自噬中类似于MdHB7的下游起作用。 我们获得了MdHB7样和MdATG18a表达上调或下调的各种类型的双转基因苹果愈伤组织，以进一步证实苹果中的这一结果（图S4）。将不同基因型的转基因愈伤组织用150mM NaCl处理5天，在苹果愈伤组织中观察到MDC标记的自噬体。MdHB7-RNAi愈伤组织表现出较低的自噬活性。然而，MdHB7样RNAi+MdATG18a-HA双转基因愈伤组织显示出高自噬活性，类似于MdATG14a-HA转基因愈伤组织（图7h，i）。此外，MdHB7样Myc+MdATG18a RNAi双转基因愈伤组织的自噬活性较低，与MdATG14a RNAi转基因愈伤组织相似（图7j，k）。这些结果进一步证明MdHB7样通过MdATG18a促进盐诱导的自噬。
图7 MdHB7样对盐胁迫下自噬的促进作用依赖于MdATG18a。 （a） MdATG18a在WT、MdHB7-like OE和MdHB7-like RNAi转基因植物的叶片中的相对表达。 （b） NaCl处理2天后叶肉细胞中自噬结构的代表性TEM图像。 （c） 不同基因型叶片的相对自噬活性如（b）所示。 （d，f）NaCl处理后各种双转基因叶片的叶肉细胞中的自噬能结构的代表性TEM图像。GL-3、MdHB7-样OE#3和MdHB7-样RNAi#1转基因植物（用红色字母标记）的叶片用于瞬时表达。使用表达GFP-HA或GFP-Myc的过表达载体和空RNAi载体（pK7GWIWG2D）作为对照。自噬体用箭头表示。 （e，g）分别在（d）和（f）中的转基因叶片中的相对自噬活性。 （h，j）盐处理后愈伤组织中MDC染色的自噬体的荧光观察。 （i，k）MDC染色的自噬体的定量。 3.7 MdHB7直接与MdCCX1启动子结合并促进其转录 在我们之前的研究中，MdCCX1抑制了细胞中过量的Na+积累，从而增强了苹果的耐盐性。在使用MdCCX1启动子对苹果cDNA文库进行Y1H筛选后，MdHB7样被鉴定为上游TF（图8a）。启动子序列分析揭示了MdCCX1启动子中四个推定的MdHB7样结合位点（图8b；图S5）。EMSA结果显示，MdHB7样直接与所有四个位点结合（图8b），在添加突变和竞争性探针后，EMSA验证了MdHB7-样在这些位点的结合特异性（图8c）。 为了在体内测试MdHB7的结合，使用WT和MdHB7-Myc转基因愈伤组织进行NaCl处理和ChIP测定。ChIP-qPCR结果表明，MdHB7样在体内直接与MdCCX1启动子中的四个位点结合（图8d）。为了确定MdHB7-like对MdCCX1转录的调节作用，我们首先测量了MdCCX1在MdHB7 like OE和MdHB7-like RNAi转基因苹果植株叶片中的表达水平。在对照和盐胁迫条件下，MdHB7样OE植物中的MdCCX1表达显著高于野生型植物，而MdHB7-like RNAi系中的MdCCX1表达明显低于盐胁迫下的野生型植物（图8e），表明MdHB7-样和MdCCX-1的表达呈正相关。随后，使用双荧光素酶系统来进一步阐明MdHB7对MdCCX1表达的积极作用。NaCl处理诱导了MdCCX1启动子的转录活性，MdHB7样蛋白的共表达显著增强了MdCX1启动子的逆转录活性，特别是在NaCl处理条件下（图8f，g）。这些结果表明MdHB7-like直接促进MdCCX1的表达。
图8 MdHB7样与MdCCX1的启动子结合并促进其表达。 （a） Y1H测定显示MdHB7样和MdCCX1启动子之间的相互作用。 （b） EMSA显示MdHB7样直接结合MdCCX1前体。 （c） 通过竞争性EMSA鉴定（b）中位点1-4的MdHB7样结合特异性。 （d） ChIP-qPCR测定显示MdHB7样在体内直接结合MdCCX1启动子中的四个位点。 （e） MdCCX1在WT、MdHB7-like OE和MdHB7-like RNAi转基因植物的叶片中的相对表达。 （f，g）双LUC测定中的荧光观察（f）和相对LUC/REN活性测量（g）。 3.8 MdCCX1在MdHB7下游调节苹果Na+流出和耐盐性 MdCCX1在PM中的亚细胞位置及其抑制酵母和植物细胞中Na+积累的能力表明，它可能是Na+外排转运蛋白。为了进一步鉴定MdCCX1对Na+外排的影响，将MdCCX-1转化到对高Na+浓度敏感的Dena1-4，Dnha1酵母突变体中。收集在吸收缓冲液中用150mM NaCl预处理8小时的酵母细胞，并将其转移到空白吸收缓冲液0、1和2小时。因此，与用pDR196载体转化的对照菌株相比，MdCCX1表达显著增加了MdCCX-1转基因酵母的Na+流出率（图9a，b）。 为了研究MdHB7-like是否通过调节MdCCX1的表达来促进Na+流出和苹果耐盐性，对MdCCX1-RNAi转基因愈伤组织和MdHB7-like Myc+MdCCX-RNAi双转基因愈伤组织进行转基因（图S6）并进行NaCl处理。由于MdATG18a介导的自噬途径抑制Na+积累并增强苹果的耐盐性（图2-5），因此使用自噬抑制剂3-MA来排除MdHB7-样MdATG18a途径的影响。在150mM NaCl处理20天后，表型分析和鲜重测量显示，在NaCl处理下，MdHB7likeMyc愈伤组织比WT生长得更好并且具有更高的鲜重，并且在MdCCX1-RNAi愈伤组织中观察到相反的模式。MdHB7like-Myc愈伤组织中MdCCX1表达的敲除显著降低了它们的耐盐性，导致MdHB7-likeMyc+MdCCX-RNAi双转基因愈伤组织和MdCCX1-RNAi愈伤组织具有相似的生长表型和鲜重（图9c，d）。此外，尽管MdHB7样Myc愈伤组织的Na+含量显著低于WT愈伤组织，但MdHB7-样Myc+MdCCX1-RNAi双转基因愈伤组织的Na+含量与MdCCX1 RNAi愈伤组织的一样高（图9e）。这些结果表明，MdCCX1在苹果中的MdHB7样介导的Na+流出和耐盐性中起下游作用。
图9 MdHB7通过MdCCX1促进Na+流出和苹果耐盐性。 （a） 表达MdCCX1的酵母菌株或pDR196载体（对照）的Na+含量在摄取缓冲液中孵育0、1和2小时。在转移到空白摄取缓冲液之前，将酵母菌株在含有150mM NaCl的摄取缓冲液中预处理8小时。 （b） 酵母在1和2小时的Na+流出率。 （c）在对照或NaCl+3-MA处理条件下培养的WT和转基因苹果愈伤组织的生长表型。 （d） 愈伤组织鲜重的测定。 （e） 愈伤组织Na+含量。  04 结论 本研究表明，MdHB7-like通过MdHB7-like-MdATG18a和MdHB7like-MdCCX1模块促进自噬活性和Na+流出，从而正向调节苹果耐盐性。 根据我们的研究结果和以前的研究结果，我们提出了一个调节模型来描述MdHB7-样在盐胁迫反应调节中的作用（图10）。暴露于盐胁迫后，MdHB7-like被迅速而显著地激活。它直接与MdATG18a启动子结合以激活其表达（图6），从而增强自噬活性（图7）。增强的自噬通过抑制过量的Na+积累、促进脯氨酸积累和ROS清除来减轻盐胁迫损伤（图2-5）。 此外，活化的MdHB7-like通过直接与MdCCX1启动子结合并激活MdCCX1表达来促进Na+的流出（图8），从而抑制Na+的过度积累并增强苹果的耐盐性（图9）。 这项研究的结果提供了见解，将有助于未来研究植物中应激诱导的自噬机制和HD-Zip转录因子介导的应激耐受调节。需要进一步的研究来阐明MdHB7样是如何在盐胁迫下被激活的（图10）。
图10 所提出的模型说明了通过MdHB7-like-MdATG18a和MdHB7-like-MdCCX1模块的MdHB7样介导的苹果盐反应。 当土壤中的盐胁迫加剧时，它会促进叶片和根中MdHB7转录的上调。随后，积累的MdHB7蛋白通过与其启动子结合直接促进MdAGT18a的表达，导致自噬增加。增强的自噬通过抑制过量的Na+积累、促进脯氨酸的积累和增强ROS的清除来减轻盐胁迫引起的损伤。此外，MdHB7通过直接促进MdCCX1在盐胁迫下的表达来增强Na+的流出，从而降低苹果植株的细胞质Na+含量，增强其耐盐性。 05 原文获取 原文链接： https://onlinelibrary./doi/10.1111/tpj.16395 PDF获取： https://www./h-nd-231.html |
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