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吗啡成瘾在全球范围内稳步上升，带来了严重的医疗和社会挑战。吗啡成瘾的特征在于强迫性药物寻求、物质依赖和致敏，通常在中枢神经系统（CNS）中引起严重的免疫应答。近年来，大多数研究都集中在解开导致成瘾和依赖生理状况的神经通路、神经元活动、神经元信号和神经元可塑性过程。然而，吗啡导致神经炎症的机制仍然不清楚。 最近的研究表明，神经炎症与神经细胞的炎症有关，代谢紊乱受损的脑区域诱导代谢的改变，其特征在于糖酵解增强，星形胶质细胞作为高度糖酵解细胞，在调节脑代谢中具有关键功能，而小胶质细胞触发的反应性星形胶质细胞在神经退行性疾病中传播神经元死亡。此外，Vicente-Gutierrez et al.提出了星形胶质细胞线粒体活性氧特异性（ROS）调节脑代谢并导致小鼠认知损伤的证据。综上研究证据，星形胶质细胞参与调节中枢神经系统糖酵解代谢的功能特征是维持正常生理过程所必需的，但它可能构成通路生理过程中的一把双刃剑。因此，本课题组致力于揭示星形胶质细胞糖酵解在吗啡诱导的神经炎症中的作用。
图1. 吗啡诱导的NAc（伏隔核）神经炎症 课题组为了确定由吗啡成瘾诱导的异常激活的脑区域，我们在每天注射盐水或吗啡4天条件性位置偏好实验后，通过用c-Fos（神经元活性的标记物）染色脑组织来检查全脑活性，免疫染色图像显示来自吗啡注射小鼠的NAc中c-Fos+表达的显著增加，证明了NAc中吗啡诱导的神经元活化。此外，课题组通过使用从吗啡处理的小鼠解剖的NAc通过RNA-seq进行转录组分析。转录组数据集的分析显示，与盐水处理的小鼠相比，吗啡处理的小鼠中数百种促炎和代谢基因的mRNA谱发生了变化，特别是与盐水处理的对照小鼠相比，吗啡注射的小鼠中Nosl、Cxcr 4、Nnmt、Hkl和TNFRSF 25的表达增加。这些数据表明吗啡诱导神经炎症。
图2. 吗啡诱导的小胶质细胞活化需要星形胶质细胞 小胶质细胞致力于中枢神经系统中先天免疫系统的组成，并且是神经免疫过程中的关键参与者。为了检测吗啡对小胶质细胞的影响，我们将小胶质细胞直接暴露于吗啡（200 μM）24小时，结果表明吗啡暴露没有增加微胶质细胞活化标志物（如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和分化簇86（CD 86））的表达。为进一步验证小胶质细胞活性受神经元信号传导调节，课题组在transwell装置中共培养神经元和小胶质细胞，并暴露于吗啡24小时，结果表明共培养系统中的神经元和小胶质细胞的存活力没有显著降低。并且小胶质细胞的活化标志物保持不变。因此进一步假设，吗啡诱导的神经炎症过程中需要介体来传递信号，课题组在transwell装置中共培养神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，并暴露于吗啡24小时，结果表明小胶质细胞中IL-6、TNF-α和CD 86的表达随着星形胶质细胞的存在而显著增加，并且共培养系统中神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的存活力没有显著改变。为了研究细胞接触依赖性机制是否是吗啡诱导的小胶质细胞炎症所必需的，课题组设计了培养基转移系统，神经元在吗啡存在或不存在下孵育24 h，然后转移神经元条件培养基（NCM）与星形胶质细胞再孵育24 h。最后，转移星形胶质细胞条件培养基（ACM）与小胶质细胞孵育24小时，结果说明ACM孵育仍增加小胶质细胞的活化标志物，炎症不是由星形胶质细胞通过细胞-细胞接触机制传播的。这些数据表明，星形胶质细胞传播吗啡诱导的促炎反应，以激活小胶质细胞与接触无关的机制。
图3. FK866处理星形胶质细胞减弱吗啡诱导的小胶质细胞活化 课题组为了研究星形胶质细胞糖酵解的调节是否可以减弱吗啡诱导的小胶质细胞炎症，将NAMPT的特异性抑制剂FK866，用于抑制NAMPT介导的NAD+补救途径来下调糖酵解。存在或不存在FK 866（10 nM）的情况下，用NCM处理星形胶质细胞24 h。然后，将ACM转移至小胶质细胞并再孵育24小时，结果显示，FK 866处理抑制了NCM处理的星形胶质细胞中的糖酵解相关标志物，包括NAD+、丙酮酸和乳酸的表达。与吗啡治疗组相比，吗啡-FK 866治疗组中小胶质细胞活化标志物的表达显著降低，为了排除用FK 866直接处理小胶质细胞，将星形胶质细胞用FK 866处理24小时，随后用新鲜培养基替换ACM，并继续将星形胶质细胞孵育另外24小时。最后，将新鲜ACM转移至小胶质细胞，其仍降低小胶质细胞活化标志物的表达。这些数据表明吗啡诱导的神经炎症与星形胶质细胞糖酵解高度相关，并且可以通过抑制星形胶质细胞糖酵解来抑制炎症信号的传播。
图4. 星形胶质细胞线粒体的过度断裂诱导小胶质细胞炎症反应 本次实验为了探讨星形胶质细胞糖酵解代谢抑制导致小胶质细胞活化下调的原因，检测线粒体功能。在活化的星形胶质细胞中，线粒体膜电位降低和线粒体超氧化物产生的增加。此外，我们测试了吗啡诱导的糖酵解升高是否影响星形胶质细胞中的线粒体动力学。在暴露于NCM 24 h后检查星形胶质细胞中的线粒体形态。共聚焦显微镜分析显示，吗啡处理组中的星形胶质细胞表现出明显的线粒体片段化，这导致更小、更圆和数量多得多的线粒体。通过qPCR，我们显示来自吗啡处理组的星形胶质细胞中Fisl（异常线粒体分裂）mRNA的显著增加和Mff（正常线粒体分裂）mRNA的减少。FK 866治疗缓解了线粒体形态学和Fis 1和Mff mRNA水平的异常。这些结果表明吗啡引起线粒体生理功能的异常。功能障碍的线粒体可以影响细胞外环境的稳态，在细胞外环境中它们能够与免疫细胞相互作用并因此触发炎症。因此，我们推测星形胶质细胞可能释放线粒体片段进入细胞内。 在培养的星形胶质细胞的培养基中检测到片段化的线粒体。通过流式细胞术对ACM的分析显示，约90%的物质是线粒体，并且吗啡组中约87%的这些线粒体过表达超氧化物。与对照组相比，吗啡处理组中的ACM含有约40倍的功能失调的线粒体。台盼蓝测定显示星形胶质细胞的活力没有显著改变，排除了由星形胶质细胞死亡引起的细胞外线粒体肾上腺素的增加。相比之下，用FK 866处理的原代星形胶质细胞的培养基含有少约60%的功能性线粒体。将不含条件培养基可溶性物质的细胞外星形胶质细胞线粒体添加到培养的小胶质细胞中诱导小胶质细胞中的相同炎症反应。相反，FK 866处理导致小胶质细胞活化标志物的表达显著降低。为了证实细胞外片段化的线粒体是从经处理的星形胶质细胞释放的神经炎性信号的中间体，我们从ACM中滤出细胞外线粒体以减弱小胶质细胞中的炎症。这些发现表明细胞外线粒体将吗啡诱导的炎症信号从活化的星形胶质细胞传播到小胶质细胞。
图5. FK866可减轻吗啡诱导的NAc神经元炎症反应 接下来，研究吗啡暴露是否损害了星形胶质细胞的线粒体动力学，透射电子显微镜（TEM）应用于检查在星形胶质细胞的线粒体超微结构。TEM显微照片显示吗啡处理组含有较小且碎片化的线粒体，并且吗啡FK 866处理组表现出正常的长管状线粒体。为了进一步验证这一点，我们量化了NAc中线粒体分裂因子的表达。结果显示，FK 866处理大大减少了FislmRNA的过表达，并挽救了吗啡诱导的Mff mRNA的表达。这些结果表明，吗啡处理通过破坏线粒体分裂的平衡，扰乱线粒体动力学在嗜酸性细胞的变化，并且FK 866治疗是能够有效地防止由吗啡诱导的线粒体碎裂。为了评估抑制糖酵解代谢是否可以减轻吗啡诱导的神经炎症，我们用FK 866（5 mg/kg）处理小鼠。结果显示，在每天注射FK 866 4天后，与吗啡处理组相比，吗啡-FK 866处理组中的NAMPT表达显著降低。随后，我们分析了NAc中小胶质细胞的形态学变化。结果表明，吗啡处理诱导小胶质细胞的活化表型，伴随着分支数量和突起长度的减少。相比之下，吗啡-FK 866处理组中小胶质细胞的形态与静息表型相同。此外，FK 866处理还下调IL-6、TNF-α、IL-1β和TLR 4的mRNA表达。这些结果清楚地表明，FK 866可通过抑制星形胶质细胞中的线粒体断裂而有效地抑制吗啡诱导的体内神经炎症。
星形胶质细胞在吗啡成瘾中作用的示意模型。吗啡诱导的CNS免疫反应需要神经元-星形胶质细胞-向小胶质细胞信号传导。吗啡刺激神经元引起星形胶质细胞糖酵解代谢激增，导致星形胶质细胞线粒体生理异常，最终诱导线粒体过度断裂。线粒体碎片释放到细胞外环境中，作为天然免疫反应的刺激剂，直接激活小胶质细胞。 综述所述，通过抑制剂或其他手段控制星形胶质细胞的糖酵解可能是治疗吗啡成瘾的有效途径。因此，本研究从免疫代谢和细胞串扰的角度为阿片成瘾的治疗提供了一种潜在的治疗策略。  https:///10.1016/j.bbi.2023.07.030 特别鸣谢 |
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