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糖尿病（DM）是一种在世界范围内广泛存在的代谢性疾病，其临床表现为长期血糖高于标准值。糖尿病及其并发症可对患者的眼睛、肾脏、神经、心脏、血管等组织器官造成损害，甚至导致死亡。2型糖尿病（T2DM）是一种常见的糖尿病类型，发病机制是胰岛素分泌受损和胰岛素敏感性降低，约90%的糖尿病患者被诊断为T2DM。新型药物治疗T2DM的机制包括靶向β细胞和肠促胰岛素轴。传统的降糖药只能用于控制血糖水平以抑制并发症，如二甲双胍、格列本脲和米格列醇。一些食用菌，如灵芝、灰树花、猴头菌等都有潜在的抗糖尿病作用。因此，探索具有良好药理作用和长期安全性的新型天然活性成分已成为治疗T2DM新药的研究方向。 蛹虫草（Cordyceps militaris）是一种具有显著降血糖作用的食药用菌，可作为新型资源食品和保健食品的原料。蛹虫草含有多糖、虫草素、腺苷及多种微量元素等多种活性成分，在这些活性物质中，虫草素是蛹虫草特有的活性成分，具有降低血糖、调节血脂异常、减轻炎症、缓解氧化应激、促进免疫调节、抗肿瘤等作用，同时可以显著调节肠道菌群。然而，虫草素和蛹虫草提取物改善T2DM的具体机制尚不完全清楚。 肠道菌群及代谢物是介导T2DM发生发展的重要因素，肠道菌群失衡可影响糖脂代谢，从而促进T2DM、非酒精性脂肪性肝病等代谢性疾病的发生发展。近年来，大量食用菌被证实通过调节肠道菌群来缓解T2DM。一般来说，微生物组学用于分析肠道菌群的结构，代谢组学用于分析肠道菌群的代谢物，以探索代谢物与疾病的关系。肠道菌群的研究主要集中在微生物组学和代谢组学方面。本研究旨在从肠道微生物组学和代谢组学角度探讨虫草素和蛹虫草提取物缓解T2DM症状的作用机制。 将小鼠随机分为对照组（ND）和模型组（T2DM）。对照组饲喂正常饲粮，模型组饲喂60%高脂饲粮（HFD）。4周后，所有小鼠均禁食，但可自由饮水18小时。模型组小鼠腹腔注射STZ，对照组注射等量的柠檬酸缓冲液。注射后第5天测定各组12 h空腹血糖（FBG）水平。随后，将所有T2DM小鼠随机分为6组：模型对照组（HFD）、二甲双胍组（PC, 350 mg/kg）、虫草素高剂量组（CCSH, 50 mg/kg）、虫草素低剂量组（CCSL, 25 mg/kg）、蛹虫草提取物高剂量组（CEH, 1.5 g/kg）、蛹虫草提取物低剂量组（CEL, 1 g/kg）。在研究结束前，所有小鼠都被喂食各自的食物。CCS组、CE组、PC组连续灌胃6周，ND组、HFD组灌胃等量0.9%生理盐水。每周测定小鼠体重和空腹血糖。在治疗的第4周和第6周无菌收集粪便样本。在实验结束时，小鼠禁食一夜，在乙醚麻醉下处死。取眼球血样，离心后取血清进行生化分析。 结果表明，高脂肪饮食导致小鼠体重下降，毛发光泽度下降，FBG升高。二甲双胍组、虫草素（CCS）组和蛹虫草提取物（CE）组FBG水平均显著低于模型对照（HFD）组，提示虫草素和蛹虫草提取物对T2DM有潜在的降血糖作用。 与ND组比较，HFD组TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低，提示T2DM会导致血脂异常。治疗组TC、TG、LDL-C水平均低于HFD组，证明CCS、CE可调节T2DM脂质代谢。HPLC法测定CCSL中虫草素的含量是CEL的122倍。但CE对TG水平的下调更为显著，说明蛹虫草提取物中存在其他潜在的调脂活性物质。 与对照组相比，HFD组小鼠具有较高的促炎因子水平和过度的氧化应激，虫草素和蛹虫草提取物可能通过降低炎症因子和减轻氧化应激发挥有益作用。T2DM小鼠血清ALT和SOD水平显著升高，CCS和CE均可缓解T2DM小鼠血清ALT和SOD水平升高，提示虫草素和蛹虫草提取物对小鼠抗氧化能力和肝脏保护具有潜在作用。与ND组相比，HFD组IL-6水平升高，而CCS和CE显著下调这些炎症因子，提示CCS和CE在调节炎症反应方面具有潜在作用。 近年来的研究表明，许多天然植物成分通过介导激效在模式生物中表现出双重功能。激效是一种以低剂量刺激和高剂量抑制为特征的双相剂量-反应关系，通常表现为J型或倒U型曲线。 CCS高、低剂量组比较，CAT、ALT、IL-6等生化指标均无显著差异。在低剂量时，它可能已经处于剂量-反应曲线模型中“J”曲线的后半部分，接近平坦。低剂量已能降低指标，高、低剂量效果差异不显著，不存在明显的剂量依赖性。在CE组高、低剂量比较中，低剂量组ALT、CAT生化指标的治疗效果较高剂量组明显，低剂量组IL-6的治疗效果也较低。推测其原因可能类似于双相剂量效应，如倒U型曲线在一定范围内，低浓度具有刺激作用，而高浓度则相对减弱这种刺激作用。这表明虫草素和蛹虫草提取物的剂量研究是重要的，需要进一步探索。 通过对16S rRNA基因进行测序，可以直观地看到CCS组和CE组肠道菌群结构的变化，从而探讨其对T2DM肠道菌群的调控作用。本研究通过评价各组肠道菌群α-多样性指数和β-多样性指数来确定样本选择的合理性。在基于欧几里得的PcoA中，可以看到每组样品都有明显的聚集。经灌胃治疗6周后，CCS组和CE组肠道菌群结构趋于ND，提示CCS和CE可改善T2DM肠道菌群紊乱。从灌胃治疗4周后的OTU Venn图可以看出，T2DM降低了肠道菌群的多样性，CCS和CE均增加了肠道菌群的多样性。灌胃4周后，在门水平上，与ND组相比，HFD组的厚壁菌门相对丰度显著降低，CCS组和CE组的厚壁菌门相对丰度升高，且呈剂量依赖趋势，并结合厚壁菌门/拟杆菌门比值，说明CCS和CE均能改善T2DM患者肠道菌群组成。 属水平的群落结构分布图显示，T2DM改变了小鼠肠道微生物群落结构，HFD组另枝菌、肠鼠杆菌和肠道核心菌的相对丰度高于ND组。与对照组相比，CCS组和CE组的拟芽孢杆菌升高。研究表明，异裂副杆菌是人体核心菌群之一，NAFLD与DM等疾病状态呈显著负相关，可能对糖脂代谢起到正向调节作用。CCS组和CE组的嗜木真杆菌组和大肠杆菌组的相对丰度高于ND组。嗜木真杆菌组可干扰支链氨基酸的分解代谢，减轻高脂诱导肥胖小鼠的体重。结肠杆菌是一种产生肌苷的细菌，可通过调节TLR4/NF-κB信号通路改变肠道微生物结构，改善脂多糖诱导的急性肝损伤和炎症，提示CCS、CE在预防肝损伤和减轻肥胖症状方面具有一定的积极作用。灌胃6周后，CCSH、CEH、CEL组氏菌属的相对丰度显著高于HFD组。氏菌是一种产生丁酸的细菌，在肠道内降解膳食纤维木聚糖，肠道菌群分泌的丁酸会促进餐后胰岛素分泌，提示CCS和CE可能通过影响肠道菌群来降低T2DM患者的血糖。拟普雷沃氏菌属短链脂肪酸产菌和抗炎菌，CCS组的拟普雷沃氏菌振幅显著大于HFD组，说明CCS对抗炎和短链脂肪酸产有积极作用。CE的治疗抑制了HFD诱导Lachnoclastic相对丰度的增加，宏基因组学显示Lachnoclastic可以作为诊断结直肠腺瘤和结肠癌的标志物，表明CE中的活性成分可以有效地保护和预防结直肠癌。值得注意的是，梭状芽胞杆菌_UCG-014仅在ND组中显示出较高的相对丰度，迄今为止研究相对较少。  图1. CCS和CE调节肠道菌群的群落结构。（A）各组灌胃4周后的OTUs花瓣图像。核心OTU代表所有群体共有的OTU，花瓣上的数字代表每个群体独有的OTU。（B）稀疏曲线烘焙（C）Shannon指数（D）PCA主成分分析。  图2. CCS和CE对T2DM患者肠道菌群结构的影响。（A）各组灌胃后第4周各处理在门水平上的群落结构分布；（B）各组灌胃第4周和第6周群落结构分布；（C）灌胃第四周肠道微生物属级差异种的热图分析。 粪便样本代谢组学研究表明，CCSH和HFD的差异代谢物富含与DM相关的一些通路，特别是过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）通路、花生四烯酸通路、PI3K/Akt通路、mTOR信号通路、FOXO信号通路、氧化磷酸化化学通路、TCA循环通路、脂肪因子信号通路。这些途径可能在虫草素调节血糖和血脂异常中发挥重要作用。 在CEH组中，PI3K/Akt/mTOR通路、PI3K/Akt/FOXO/ PEPCK通路仍然存在。此外，通过代谢途径富集分析，发现CEH处理后一些氨基酸代谢途径发生了变化，具体包括色氨酸代谢途径、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢途径以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径。色氨酸已被证明可以转化为血清素，而血清素又可以转化为褪黑素。研究表明，褪黑素与胰岛素抵抗有关，可以改善胰岛素抵抗，参与调节葡萄糖稳态。可见，氨基酸代谢在CEH调节血糖的过程中发挥了作用。因此，CEH调节血糖的机制可能与氨基酸代谢有关。 CCSH和HFD的差异代谢物包括酚类、脂肪酸、苯丙酮、嘧啶核苷、羧酸及其衍生物、吡啶及其衍生物。特别是苯丙酮化合物儿茶素可以降低T2DM的脂质积累，增加胰岛细胞数量，在T2DM的治疗中具有潜在的作用。CEH和HFD的差异代谢物中有醇类、氨基酸、脂肪酸等。研究表明，一些支链氨基酸、芳香氨基酸及其衍生物、脂肪酸与糖尿病的发生高度相关。芥酸是一种脂肪酸，与脂质、脂蛋白合成和血浆葡萄糖升高有显著正相关。芥酸含量高容易导致心肌病和脂肪沉积。与HFD组相比，CE组的芥酸水平显著降低，说明CE可以改善血糖代谢和血脂代谢。根据不同粪便样本的代谢组学分析结果，小鼠通过肠道微生物与宿主的相互作用产生了许多不同的代谢物，这些代谢物与许多代谢途径有关，主要集中在PI3K/Akt/PPAR、PI3K/Akt/mTOR、PI3K/Akt/FOXO/PEPCK途径、色氨酸代谢途径、丙氨酸-谷氨酸代谢途径、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径、不饱和脂肪酸合成途径，TCA循环途径。由此推测，虫草素和蛹虫草提取物可能通过这些途径影响T2DM的胰岛素抵抗、血糖水平、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、抗炎能力和能量供应，从而缓解T2DM的症状。 综上所述的研究结果表明，作为一种食用菌，蛹虫草可以缓解小鼠T2DM，为利用蛹虫草改善人类健康提供了科学依据。  原文发表于: Front. Pharmacol. 14:1134429. doi: 10.3389/fphar.2023.1134429  |
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