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各位老师，大家好！我是14号组“铸麦逐梦”的杨斌，根据组长杜立丰老师的安排，今天由我代表小组值日。我们组的成员有张三坤、卫波、秦志英、张中州、望俊森、李继平、徐开杰、李玮、宋瑜龙、韩然、杨子博、何明琦、袁雨豪、崔培涛、温小伟、金燕、缑金营、高宏伟等老师。我值日的文章题目是“小麦旗叶叶绿素含量遗传分析”，不妥之处望各位老师批评指正。
在遭受逆境胁迫时，叶绿素含量较高的小麦品种可以保持较强的光合能力，有助于产量稳定形成[1]。叶绿素的合成与降解由多基因调控，易受到环境的影响，对叶绿素含量进行QTL分析，发掘稳定主效QTL，不仅有利于完善叶绿素调控的遗传机制[2,3]，亦有助于分子标记辅助选育小麦高光效品种。目前已检测到的位点普遍效应较低，易受环境条件影响，且多在个别环境下进行，缺少多环境中验证。因此，利用高密度遗传连锁图谱，在多年多点的不同环境中检测旗叶叶绿素含量QTL，并在不同遗传群体中进行验证，有利于发掘稳定主效QTL。
迄今，尚无小麦旗叶叶绿素含量相关QTL精细定位的报道，仅有利用早衰突变体对持绿主效位点进行精细定位的研究，如Li等[4]利用早衰突变体M114构建的F2群体进行了BSR-Seq分析，将els1基因定位在2BS染色体上，遗传距离为1.5 cM；Wang等[5]利用早衰突变体LF2099构建的F2群体，将els2基因定位在2BL上2BIP09-2BIP14的标记区间。通过同源克隆已获得Tackx4、Tabas1-B1和TaPPH-7A等调控叶绿素的相关基因[6-8]，但并未进行转基因验证。目前在多个环境中检测到的叶绿素含量主效QTL报道较少，因此利用遗传群体和自然群体挖掘定位叶绿素含量有关的主效QTL，对于认识小麦叶绿素调控机制很有价值。本研究以DH群体(晋春7号×金麦919)为材料，利用90K芯片在5个环境中对小麦旗叶叶绿素含量进行QTL分析，发掘调控旗叶叶绿素含量的稳定主效QTL，并开发KASP分子标记，为进一步基因克隆和分子育种提供有价值的信息。
一、旗叶叶绿素含量表型分析
对5个环境下的双亲和DH群体旗叶叶绿素含量进行方差分析，结果表明，晋春7号的旗叶叶绿素含量为46.17~58.59，金麦919为44.43~57.79，晋春7号均高于金麦919，其中在E1、E4和E5环境中差异显著(P <0.05) (表1)。DH群体叶绿素含量的变异范围为48.42~56.90，峰度与偏度绝对值大多小于1，表明各环境中叶绿素含量均呈现连续性正态分布，适用于QTL分析。叶绿素含量的H2为0.58，说明叶绿素含量主要受遗传因素影响。 二、旗叶叶绿素含量QTL分析
对DH群体的旗叶叶绿素含量进行QTL分析，共检测到20个控制叶绿素含量的QTL，分布于2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、4D、6A和6B染色体上，LOD值介于2.55~13.60之间，可解释4.10%-27.16%的表型变异率，其中6个QTL加性效应来自于晋春7号，14个QTL加性效应来源于金麦919。Qchl.saw-2D.1、Qchl.saw-4D.2和Qchl.saw-6A能在多个环境中检测到，可解释4.10%~26.07%的表型变异率。其中位于2DS染色体BS00012148_51~Excalibur_c18324_390标记区间的Qchl.saw-2D.1对表型的贡献率大于10%，加性效应来自于金麦919，是1个稳定主效QTL。
三、稳定QTL位点的聚合效应
对检测到的3个稳定QTL Qchl.saw-2D.1、Qchl.saw-4D.2和Qchl.saw-6A的加性效应分析表明，随着有利等位基因数量的增多相关株系旗叶叶绿素含量增高(图1-A)，具有3个有利等位基因的家系的叶绿素含量极显著高于缺失这些等位基因的家系(P <0.01)。DH群体中仅具有Qchl.saw-2D.1有利等位基因的家系的旗叶叶绿素含量高于仅具有Qchl.saw-4D.2和Qchl.saw-6A等位基因的家系，表明Qchl.saw-2D.1对叶绿素含量的遗传效应最高。此外，根据Qchl.saw-2D.1连锁的SNP标记将DH群体划分为两类，携带有金麦919 (正向增加叶绿素含量)等位变异的家系与携带有晋春7号等位变异的家系在各环境中差异均极显著(P <0.01)，金麦919等位变异可增加0.49-3.41的叶绿素含量(图1-B)。
四、Qchl.saw-2D.1标记开发与验证
根据中国春参考基因组序列v1.0，发现已有研究在2D染色体上定位到的叶绿素QTL位于23.03~570.40 Mb区间内，而本研究检测的Qchl.saw-2D.1定位在2DS的3.77~7.97 Mb区间内，物理间距为4.20 Mb (图2-A，图2-B)，此区段内尚无叶绿素含量QTL/基因的报道，可以初步确定Qchl.saw-2D.1是1个新的叶绿素含量有关的主效QTL。
为了验证Qchl.saw-2D.1的遗传效应，利用其连锁SNP标记Excalibur_c18324_390设计KASP标记，命名为Qchl-2D.1-KASP。在RIL群体(DH118×金麦919)中进行QTL验证 (图2-C)，结果表明，携带有金麦919等位变异有68个家系，携带有DH118的等位变异家系有97个，组间在E2和E6环境中差异显著(P <0.05)，在E1和E3环境中差异极显著(P <0.01)，说明Qchl.saw-2D.1具有较强的增加旗叶叶绿素的作用。
五、讨论
旗叶叶绿素含量受多基因调控，易受环境因素影响，发掘叶绿素含量有关的稳定主效QTL是应用于分子标记辅助育种的前提。目前已检测到上百个控制叶绿素含量的QTL[9]，但共定位的QTL较少。造成这种现象的原因：1)叶绿素检测方法不同，有些研究使用分光光度计测定[10]，有些采用叶绿素仪测定[11]，表型值的差异会导致定位结果不同；2)控制数量性状的基因表达具有时空特异性，调控叶片叶绿素含量的QTL在各发育时期具有差异[12]，现有研究分为苗期、抽穗期以及灌浆中后期，检测时期的不同造成鉴定出的QTL具有差异；3)分子标记的类型不同，造成不同研究结果无法直接进行比较；4)检测到的QTL多数效应值较低，定位结果易受环境因素干扰。因此，能够在不同研究中或不同环境下被多次检测到，且具有较高表型贡献率的主效QTL，可能更具应用于分子标记辅助育种的潜力。
本研究在2D染色体3.77-7.97 Mb区间检测到1个叶绿素含量的稳定主效QTL Qchl.saw-2D.1，该区间内尚未见到叶绿素QTL的报道，表明Qchl.saw-2D.1是1个新的主效叶绿素含量QTL。后续工作我们将构建次级分离群体，筛选重组株，重点对Qchl.saw-2D.1进行精细定位。
主要参考文献：
[1] Kumar S, Sehgal S K, Kumar U, Prasad P V V, Joshi A K, Gill B S. Genomic characterization of drought tolerance-related traits in spring wheat. Euphytica, 2012, 186: 265–276.
[2] Thomas H, Ougham H. The stay-green trait. J Exp Bot, 2014, 65: 3889–3900.
[3] Verma V, Foulkes M J, Worland A J, Sylvester-Bradley R, Caligari P D S, Snape J W. Mapping quantitative trait loci for flag leaf senescence as a yield determinant in winter wheat under optimal and drought-stressed environments. Euphytica, 2004, 135: 255–263.
[4] Li M, Li B, Guo G, Chen Y, Xie J, Lu P, Wu Q, Zhang D, Zhang H, Yang J, Zhang P, Zhang Y, Liu Z. Mapping a leaf senescence gene els1 by BSR-Seq in common wheat. Crop J, 2018, 6: 236–243.
[5] Wang N, Xie Y, Li Y, Wu S, Li S, Guo Y, Wang C. High-resolution mapping of the novel early leaf senescence gene els2 in common wheat. Plants-Basel, 2020, 9: 698–710.
[6] Chang C, Lu J, Zhang H P, Ma C X, Sun G. Copy number variation of cytokinin oxidase gene Tackx4 associated with grain weight and chlorophyll content of flag leaf in common wheat. Plos One, 2015, 10: e0145970.
[7] Zhu X F, Zhang H P, Hu M J, Wu Z Y, Jiang H, Cao J J, Xia X C, Ma C X, Chang C. Cloning and characterization of Tabas1-B1 gene associated with flag leaf chlorophyll content and thousand-grain weight and development of a gene-specific marker in wheat. Mol Breed, 2016, 36: 142–153.
[8] Wang H, Wang S, Chang X, Hao C, Sun D, Jing R. Identification of TaPPH-7A haplotypes and development of a molecular marker associated with important agronomic traits in common wheat. Bmc Plant Biol, 2019, 19: 296–307.
[9] Gupta P K, Balyan H S, Gahlaut V. QTL analysis for drought tolerance in wheat: present status and future possibilities. Agronomy-Basel, 2017, 7: 5–25.
[10] Zhang K, Zhang Y, Chen G, Tian J. Genetic analysis of grain yield and leaf chlorophyll content in common wheat. Cereal Res Commun, 2009, 37: 499–511.
[11] Bhusal N, Sharma P, Sareen S, Sarial A K. Mapping QTLs for chlorophyll content and chlorophyll fluorescence in wheat under heat stress. Biol Plantarum, 2018, 62: 721–731.
[12] Yang D, Li M, Liu Y, Chang L, Cheng H, Chen J, Chai S. Identification of quantitative trait loci and water environmental interactions for developmental behaviors of leaf greenness in wheat. Front Plant Sci, 2016, 7: 273–288. 作者简介：杨斌，男，1983年生，陕西汉中人，博士，副研究员，硕士生导师，山西农业大学小麦研究所分子育种研究室主任。主要从事小麦抗旱种质资源创制及抗旱分子机理研究。在《Frontiers in Plant Science》、《作物学报》、《应用生态学报》等刊物以第一或通讯作者发表论文15篇；授权国家发明专利3项，参与审定小麦品种3个。 |
