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1.TTK过度表达与人类HCC的预后不良相关为了了解TTK在人类HCC中的临床相关性，作者通过转录组测序和定量实时PCR（qPCR）评估了HCC组织和其配对的非肿瘤肝（NT）组织中TTK的表达水平。至少有两倍的TTK在90%（54/60例）的HCC患者中上调。通过免疫组化（IHC）进一步证实了蛋白水平的上调。作者对HCC和NT组织的转录组测序数据进行了基因本体论（GO）分析。作者通过作者的内部RNA测序（RNA-seq）数据通过Spearmen相关性分析检查了TTK与其他基因之间的表达相关性。GO分析显示，TTK共表达基因（r < 0.6）在有丝分裂和细胞分裂通路中显著富集，暗示了TTK在HCC中可能的功能。作者进一步将作者的研究验证到了来自The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库的更大的患者队列中。一致地，TTK在人类HCC中显著过表达，高TTK表达与整体生存和无病生存差的关联（此外，TTK在不同的实体肿瘤类型中过度表达，表明其在癌症进展中的重要性）。
2.TTK通过维持适当的细胞周期进展来促进HCC的生长为了研究TTK在HCC发展中的作用，作者利用短发夹RNA（shRNA）敲低方法，在一个荧光素酶标记的人类HCC细胞系MHCC97L中生成了稳定的TTK敲低克隆。TTK的敲低导致染色体错配，因为它作为一个SAC蛋白负责这一功能（17），并且进一步增加了DNA损伤，这可以通过免疫荧光染色中的γH2A.X标记来证实。作者将TTK敲低克隆（sh12和sh20）和配对的非靶向对照（NTC）通过正位植入BALB/cAnN-nu小鼠和通过尾静脉注射NOD-SCID小鼠。此外，作者观察到HCC细胞系（Hep3B、Huh7、MHCC97L、PLC/PRF/5和Hepa1-6）对CFI-402257的敏感性高于正常肝细胞（MIHA），这表明它们的GI值较低。作者对使用CFI-402257培养的HCC细胞的染色体含量进行了分析，TTK抑制导致MHCC97L和其他HCC细胞系中出现了更多的非整倍体细胞。大多数CFI-402257处理的细胞显示出>2N和>4N水平的倍性。综上所述，TTK通过调节适当的细胞周期传播和确保染色体分离的准确性促进了HCC的生长。 3.CFI-402257 在体内有效抑制HCC的生长和转移作者进一步研究了CFI-402257在不同的小鼠HCC模型中的治疗潜力。作者在BALB/cAnN-nu小鼠中正位植入MHCC97L。在肿瘤形成后的2周内，口服给予小鼠CFI-402257或对照组（Ctrl）。值得注意的是，CFI-402257通过抑制TTK使HCC肿瘤缩小，并减少肺转移。此前，作者发现TTK过表达与人类HCC中的TP53突变/缺失密切相关。为了生成一个与人类HCC的遗传构成相似的小鼠模型，作者通过水动力尾静脉注射（HDTVi）将CRISPR/Cas9系统引入免疫能力正常的C57BL/6小鼠中，敲除Trp53并表达C-Myc的转座子系统。在HDTVi后3周形成肿瘤后，作者给予小鼠CFI-402257或对照组。治疗17天后，对小鼠进行磁共振成像（MRI）扫描，显示肿瘤显著缩小。 经过21天的治疗，作者杀死了小鼠，并明确确认CFI-402257显著减小了Trp53 KO /Myc OE HCC肿瘤的大小，而且没有出现不良毒性，这表现在体重和肝组织的血红素/伊红染色没有显著变化。 4. CFI-402257在肝细胞癌中引发类似衰老的反应和SASP分泌CFI-402257抑制TTK后，破坏了SAC保护，导致非整倍体现象和染色体错位。通过关闭SAC，有丝分裂期间的着丝粒-微管连接得不到检查，未连接的着丝粒的出现导致染色体不均等分离和微核的形成（20, 21）。人类HCC细胞经过CFI-402257处理后，核染色显示出微核的形成。此外，CFI-402257处理增加了DNA损伤，这是缺乏功能性SAC的另一个后果（17），因此与之前显示的TTK沉默的效果相呼应。CFI-402257通过破坏染色体分离过程触发了微核的形成。此外，微核的核膜易于破裂，从而导致双链DNA泄漏到细胞质，激活细胞DNA感知途径（22, 23）。作者发现CFI-402257还增加了HCC细胞中的细胞质DNA。作者假设在有丝分裂期间，着丝粒的张力丧失导致染色体双向定位的失调，再加上无法修复的DNA损伤的积累，将导致细胞衰老。为了证实作者的假设，作者通过衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测了HCC细胞中的衰老样反应，并发现CFI-402257广泛诱导衰老。
5.CFI-402257通过DDX41-STING-IRF3/7-Nuclear Factor κB轴触发SASP转录微核形成和细胞质DNA积累会刺激STING通路（22），这可能是由CFI-402257引起的。STING是细胞质DNA感知通路的关键调节因子，当细胞质DNA受到DDX41、IFI16和cGAS等多个传感器的感知时，会引发促炎细胞因子信号的产生（26）。激活的STING以二聚体形式从内质网转位到高尔基体，在那里被酰化和TBK1磷酸化。STING-TBK1-IRF3复合物导致IRF3的磷酸化、二聚化和核转位。该复合物还磷酸化IκB，导致核因子κB（NF-κB）的核转位。最终，干扰素刺激基因（ISGs）和SASPs的转录被激活（27）。作者通过CFI-402257培养的细胞中确认了STING及其下游介质IRF3的激活，因为这些蛋白质的磷酸化增加，以及二聚化STING的形成增加。为了调查STING介导的DNA感知途径（27, 28）是否对SASP上调有贡献，作者评估了DDX41、STING、IRF7和RelA（NF-κB的一个亚单位）稳定敲低克隆中的两个代表性SASP基因。 6.质谱细胞学分析显示，在CFI-402257治疗后，肝细胞癌肿瘤中的免疫细胞浸润增加之前，作者展示了CFI-402257通过激活STING通路从HCC细胞中诱导SASP表达和分泌，并显著抑制了HCC的生长。这些SASP的趋化因子和细胞因子可以改变浸润免疫细胞的数量和其在肿瘤微环境中的功能状态，从而影响靶向治疗的临床结果。因此，作者使用质谱细胞术（CyTOF）来广泛分类Trp53 KO /Myc OE 背景肿瘤中浸润的免疫细胞群体。与传统流式细胞术相比，质谱细胞术可以同时染色更多的标记物。作者的抗体面板包括10个标记物用于分类主要的免疫细胞系列，以及30个标记物用于根据它们的激活、分化、动员和耗竭状态（例如KLRG1、PD-1、TIGIT、TIM3和LAG3）对肿瘤浸润的T细胞和NK细胞进行分层（19）。作者同时分析了在给予或不给予CFI-402257治疗的小鼠的HCC肿瘤中免疫细胞上的所有40个标记物的表达情况。 作者进一步通过流式细胞术和免疫组化染色验证了主要免疫细胞群体的动态变化，一致地发现淋巴细胞群体（CD4 T细胞、CD8 T细胞和NK细胞）仅在HCC（T）而非非肿瘤（NT）区域中增加。总之，作者的免疫细胞分析数据表明CFI-402257促进了抗肿瘤免疫。 7.质谱细胞学分析显示，在HCC肿瘤中，CFI-402257治疗后，TIL中的PD-1表达上调作者确定T细胞是HCC肿瘤中的主要群体，并且在CFI-402257治疗后大幅增加。T细胞在癌症免疫中起着核心作用（31, 32）。为了进一步了解CFI-402257治疗后的人群变化，作者使用了与上述总白细胞分析相同的方法（UMAP和phenograph）来分析T细胞。作者观察到群集2（CD8 T效应记忆）增加，而群集1、5和9（CD4 T效应记忆和CD8 T中央记忆）减少。在UMAP图上澄清了所有T细胞标记物的表达水平，以及在phenograph上的群集位置。为了比较CFI-402257治疗和对照小鼠中T细胞的活性，作者对CD4 T和CD8 T效应记忆细胞进行了筛选，并评估了不同功能标记物的表达，包括粒酶B（GZMB）、ICOS、OX40、PD-1、CTLA4和TIGIT（33）。
8.CFI-402257通过STING部分介导抗肿瘤效应，并与免疫检查点抑制剂协同作用为了验证STING在CFI-402257在体内的作用重要性，作者在小鼠中建立了Sting HCC肿瘤，并对其进行了车辆对照组（Ctrl）或CFI-402257的治疗。值得注意的是，作者观察到STING的缺失减弱了CFI-402257的生存益处。通过比较Ctrl组和CFI-402257治疗组的中位生存天数，作者发现CFI-402257在Sting组中促进了更长的生存时间（58天对110天），但在Sting组中没有（61天对68天）。
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