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活性氧(Reactive oxygen species, ROS)在土壤生物地球化学过程中起着关键作用，但对其在根际的发生和积累的研究却很少。在此，我们首先开发了一种ROS捕获膜来原位测定黑麦草根际中的ROS，然后量化代表性ROS(即O2·, H2O2和·OH)的时空变化。荧光成像清晰地显示了根际ROS的产生。在整个黑麦草生命周期中，O2·和H2O2含量均呈现先上升后下降的趋势，而·OH浓度则持续下降。从空间上看，ROS含量在0 ~ 5 mm处保持较高水平，随着距离的增加而下降。不同土壤中活性氧浓度依次为黑土>红壤>黄棕壤>层状土~红壤。土壤性质分析表明，生物因子(微生物群落)和非生物因子(铁(II)和水溶性酚)在ROS的产生中起关键作用。包括铁(II)和水溶性酚介导的电子转移、微生物群落驱动的胞外O2·释放和铁(II)/铁(III)循环在内的联合过程可能负责ROS的产生。这些发现提供了ros相关的根际效应的见解，并为污染物的植物修复和元素循环提供了灵感。近年来，人们对暗条件下ROS的生成也进行了研究，认为这与动态界面上的氧化还原反应有关。例如，Sutherland等人通过将厌氧微生物呼吸产生的细胞外电子暴露于分子氧中，揭示了ROS的暗生成此外，ROS还可以通过氧化-缺氧循环(如水浸-干燥过程)将还原的地质材料(如铁矿物或天然有机物)的电子转移到分子氧的过程产生。植物的生长确实会引起根际土壤化学和生物特性的变化，如pH值、根渗出液、酶活性和微生物群落，导致根-土界面活性的变化，并可能反过来影响ros的产生。例如，有机酸(如草酸、阿维酸和甘氨酸)作为根渗出液的主要成分，在与土壤成分(如含铁矿物)相互作用过程中诱导活性氧的产生。根系渗出物和其他土壤成分的模式通常随植物的生长周期和土壤到根系的距离而变化。然而，根际活性氧的时空分辨率在很大程度上仍未确定。为了验证ROS在根际的原位生成，我们首先以DCFH-DA为底物研制了ROS捕获膜，DCFH-DA与ROS反应后转化为具有荧光特性的DCF。如图1a、b所示，荧光成像清楚地显示ROS在根-土界面上积累，表明黑麦草根际有ROS的产生。为了进一步验证根际土壤中ROS的积累情况，采用EPR联合自旋诱捕剂DMPO对培养21 d后根际和非根际土壤中ROS的水平进行了半定量分析。EPR谱显示，二甲亚砜(DMSO)对根际土壤悬浮液中的DMPO-O2·o加合物具有超细分裂，而对非根际土壤的EPR信号变化不明显(图1c)。在含根际土壤的水悬浊液中检测到相对强度为1:2:2:1的四线信号，这是典型的·OH信号特征(aN = aH = 14.9 G的超细耦合常数)(图1d) 结果表明，活性氧在根际土壤中积累，而在非根际土壤中不积累。
为了更深入地了解根际ROS的形成，我们通过分子探针方法定量了三种代表性ROS的浓度，包括O2·o, H2O2和·OH。采用盆栽和根箱试验，系统研究了根际土壤中各种活性氧的时空演变规律。在非根际土壤中均检测到3种类型的活性氧;然而，它们的浓度随黑麦草生长的变化可以忽略不计，在不同类型的土壤中保持恒定的水平(图S4)。相比之下，根际土壤中的ROS浓度是非根际土壤的2 ~ 10倍，并且在黑麦草的整个生命周期中变化显著(图2a ~ c)。其中，5种根际土壤的O2·浓度在培养前9 d逐渐升高，黑土、红壤、黄棕土、红壤和层状土的O2·浓度分别达到最大值16.64、15.17、13.57、8.24和8.64 μM/kg(图2a)。之后，在培养33 d后植株枯萎时，O2·o含量逐渐下降到初始水平。黑土、红壤、黄棕土、红壤和层状土的H2O2浓度在第9天达到最大值，分别为19.36、15.58、12.14、8.74和9.80 μM/ kg(图2b)。与O2·o和H2O2不同，·OH浓度在预孵育后达到最大值，然后在黑麦草孵育期间逐渐降低(图2c)。此外，不同土壤类型的活性氧浓度也存在明显差异，黑土中活性氧浓度最高，其次是红壤和黄棕土，红壤和层状土中活性氧浓度最低(图2a−c和S4)。如图2d−f所示，三种ROS的浓度都受到接近根部的影响。在0 ~ 10 mm范围内，O2·o浓度在根际区域(≤5 mm)保持一个恒定的高水平，然后随着根际距离的增加(>5 mm)逐渐降低(图2d)。同样，H2O2和·OH含量也在0 ~ 5 mm区域保持恒定且较高的水平，然后在远根际随着距离的增加而降低(图2e,f)。在0 ~ 5 mm范围内，根际区3种ROS的浓度随距离的增加略有增加，然后下降(图2d - f)。结果表明，不同土壤类型间活性氧含量差异显著且相似，从黑土到层状土呈递减趋势。
已有研究报道，土壤中的氧化还原组分如Fe(II)、DOC以及酚类化合物与ros的产生密切相关。因此，我们分别研究了这些物质在根际的变化与黑麦草生长和离根距离的关系。如图S5a所示，5种根际土壤Fe(II)含量在培养前9 d显著降低，各土壤Fe(II)含量达到8.32 ~ 37.43 mg/kg的平衡。不同土壤中DOC浓度的变化也有类似的现象(图S5b)。可以看到，Fe(II)和DOC含量的变化趋势与·OH含量的变化趋势一致(图2c)。相比之下，不同土壤的水溶性酚含量在6 ~ 9 d时增加到最大值，然后随着培养时间的推移下降到初始水平(图S5c)。根箱试验中，不同土壤各区Fe(II)浓度保持恒定水平(图s5d)。然而，不同土壤的DOC和水溶性酚含量在根际区域保持较高的恒定水平，然后随着远根际距离的增加而降低(图S5e、f)。根系分泌物不仅能刺激微生物活性，还能与土壤矿物质发生反应，从而促进活性物质的产生，如ros。本文首次从不同根际土壤中提取了22种根系分泌物，并对其进行了测定。通过GC - MS共鉴定出143种化合物，分别为糖(26种)、糖醇(12种)、有机酸(92种)和酰胺/胺(13种)。不同土壤类型根系分泌物中不同化合物的数量和相对丰度变化不显著(图S6a、b)。在不同孵育时间(如0、3、9、15、21和33 d)下，黑土根际土壤的根分泌物也被检测。化学物质的类型基本相同，但有几种化合物的丰度存在明显差异(图S6c,d)。随着黑麦草的生长，有机酸的数量先增加后减少(图S6c)。有机酸的相对丰度也随着黑麦草的生长先升高后降低(图S6d)。对不同根际土壤脲酶和脱氢酶的活性进行了检测，因为这两种酶通常被用来反映微生物的活性5种根际土壤中脲酶和脱氢酶的活性随着时间的增加而迅速增加，在6 ~ 9 d达到峰值，然后随着培养时间的延长而下降到初始水平(图S7a,b)。在黑麦草的整个生命周期中，不同土壤间的差异不显著。此外，还检测了与ROS相关的过氧化物酶(如过氧化氢酶、漆酶和锰氧化酶)的活性过氧化氢酶的活性与脲酶和脱氢酶表现出相似的时间依赖性，在第9天达到最大值，黑土、红壤、黄棕土、红壤和层状土的过氧化氢酶活性分别为3.50、3.02、2.52、2.16和2.21 mgH2O2/g/20 min(图S7c)。漆酶和锰氧化酶活性未检测到。这可能是由于在根际活动中参与底物(如木质素)氧化分解的微生物活性较低，这表明根际中ROS的产生可能不是由漆酶和锰氧化酶介导的。此外，根箱内各种酶的活性也表现出不同的特征(图S7d - f)。脲酶、脱氢酶和过氧化氢酶活性在根际区域保持较高水平，在远根际随距离增加而降低。同样，漆酶和锰氧化酶的活性也未检测到。
为了确定土壤微生物在ROS产生中的潜在作用，在Illumina MiSeq平台上对根际土壤进行了高通量土壤细菌和真菌16S rDNA基因测序。结果表明，不同培养时间和不同类型土壤培养9 d的黑土中，Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Bacteroidota和gemmatimonadees是优势菌门(图3a)。黑土中优势菌门的相对丰度随着时间的增加而迅速增加，在第9 d达到峰值，然后下降。各土壤优势菌门的相对丰度依次为黑土>红壤>黄褐色土~层状土~红壤。同时，子囊菌门(Ascomycota)、未分类菌门(Fungi_unclassified)、担子菌门(Basidiomycota)、Zygomycota和壶菌门(Chytridiomycota)是各根际土壤的优势真菌门，但相对丰度没有显著差异(图3b)。
由图S8a、b可知，黑土细菌的Chao1、观测种、Shannon、Simpson指数在第9天最高，不同土壤的细菌多样性依次为黑土>层状土>红壤>红壤>黄褐色土。真菌方面，Chao1、观察种、Shannon、Simpson的指数随时间增加，在第3天达到峰值，然后下降(图S8c、d)。不同土壤真菌多样性表现为红壤>层状土>黑壤>黄棕壤>红壤。此外，黑土不同耕作时间和不同土壤类型的细菌群落结构都发生了变化(图S9a,b)。真菌在不同土壤中的群落结构是相互分离的，而在黑土中不同栽培时间的群落结构是聚集在一起的(图S9c,d)。
根际互作生物学研究室 简介
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