| 栽培草莓(Fragaria x ananassa)属八倍体,果实香甜可口、营养丰富,深受消费者喜爱。草莓果实为“假果”,是由花托膨大发育而来,成为鲜嫩多汁的果肉;真正的果实分布在花托的表面,称之为瘦果。由于栽培草莓高度杂合,在栽培过程中常采用匍匐茎进行营养繁殖,以保持优良的果实品质等性状。因此,草莓的花托和匍匐茎是极为重要的器官。草莓授粉受精后花托膨大,若将花托表面的瘦果去除会导致花托停止膨大,而外源的生长素可以使花托恢复膨大,表明瘦果中合成的生长素是促进花托膨大发育的重要原因,但是瘦果中哪些部位或组织合成的生长素促进了花托的膨大仍不清晰。另外,匍匐茎作为重要的繁殖器官,其形成的分子机理和调控网络尚不清晰,对匍匐茎的形成机制进行深入研究具有重要的生产指导价值。本研究主要以二倍体森林草莓为材料,解析了草莓生长素合成调控果实发育的功能及匍匐茎形成的分子调控机制,主要研究结果如下:首先利用农杆菌介导的稳定转化技术获得了生长素报告启动子DR5_(ver2)::GUS的森林草莓转基因材料,然后通过GUS染色指示种子、花托和根中生长素的分布情况。结果发现在授粉受精作用之前,种子和花托中都没有生长素积累;授粉受精之后,种子中的生长素主要积累在受精胚以及种皮的合点端,花托中的生长素则集中分布在维管组织以及花托表面与瘦果接触的部位。氨基转移酶(Tryptophan Aminotransferase of Arabidopsis,TAA)和黄素单加氧酶(YUCCA)是生长素生物合成途径中的限速酶。通过对实验室已有的41个不同草莓组织的转录组数据进行分析,发现Fve TAAs和Fve YUCs的表达模式具有显著的组织特异性。为了进一步解析生长素在瘦果中的合成部位,我们选取了在种子中高表达的两个Fve TAAs和四个Fve YUCs,构建了其基因启动子驱动GUS报告基因的转基因材料,从而获得了这些基因在细胞水平上的表达模式。结果显示,Fve YUC4主要在种胚中表达,Fve TAR1、Fve YUC5、Fve YUC10和Fve YUC11则在胚乳中表现出不同的表达模式。另外,这些基因在草莓的根尖和侧根原基中同样具有特异的表达模式。我们采用CRISPR/Cas9技术创建了Fve YUC10的突变材料。与野生型相比,fveyuc10突变体果实中生长素含量显著降低,但是形态上没有显著的发育缺陷。这些结果表明森林草莓中生长素主要在种皮合点端、胚、花托的管脉系统、根尖以及侧根原基处积累;生长素瘦果中的生物合成主要发生在受精胚和胚乳中,推测胚乳是草莓果实花托膨大所需生长素的主要合成部位。实验室前期在EMS突变体库中获得一株雄蕊缺失的森林草莓突变体,命名为loss of axillary meristems(lam)。基因克隆结果表明LAM基因(Fv H4＿3g41310/gene01184)是水稻MOC1、拟南芥LAS、番茄LS基因的同源基因,相应的蛋白属于GRAS转录因子家族。由于这些同源基因调控了腋芽的形成,因此我们推测LAM可能调控草莓匍匐茎的形成过程。统计结果表明,lam突变体中分枝数量和匍匐茎数量显著减少,原因在于侧芽原基不能形成。并且在突变体中表达LAM基因则会使分枝数量恢复正常,lam~(CR)突变体中匍匐茎数量相应减少,进一步证实了LAM可以促进匍匐茎的形成。RNA原位杂交实验和LAMpro::GUS转基因植株的GUS染色分析均表明LAM基因在茎尖分生组织、幼叶、腋芽等部位表达。赤霉素(GA)可以促进草莓匍匐茎的伸长,且依赖于LAM基因功能,多效唑(PBZ)则抑制匍匐茎的伸长并使其转变为分枝。前人研究表明,srl突变体可以使原本不形成匍匐茎的草莓品种形成大量匍匐茎,其致突变基因为赤霉素(GA)信号途径中的DELLA基因Fve RGA1。我们发现srl lam双突变体不能形成匍匐茎,说明lam突变体在匍匐茎形成时上位于srl突变体。另外,通过酵母双杂交筛库,我们找到了125个与LAM互作的蛋白,其中包括Fve RGA1。进一步体内和体外实验确认了LAM和Fve RGA1蛋白的互作关系。综上所述,在草莓中,LAM基因是匍匐茎形成所必须的,其功能是促进腋芽的起始,Fve RGA1继而抑制腋芽的伸长生长,两者顺次调控匍匐茎的形成。 ... |
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