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一、引言 转染是分子生物学和细胞生物学研究的重要技术，它允许我们向细胞引入外源基因，从而进行基因功能研究、基因表达调控，或是进行基因治疗等。本文将详细介绍转染的概念、分类、应用场景、步骤，常用于转染的细胞类型、以及大家常用试剂等方面来介绍此技术。 二、转染概念 转染，顾名思义，是指将某种物质转移到细胞内。在生物医学研究中，这个“物质”通常指的是DNA或RNA。通过转染，我们可以向细胞引入新的基因，或者沉默或敲低细胞内的某个基因，从而研究该基因对细胞生命活动的影响。 三、转染的分类 根据转染物质的种类，转染可分为DNA转染和RNA转染。 DNA转染是指将外源DNA分子导入真核细胞的过程，它是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。通常用于基因表达和蛋白质合成的研究。 而RNA转染指将RNA分子导入细胞的过程，则主要用于干扰RNA的研究，以探究特定基因的功能。 根据转染的稳定性和效率，转染又可以分为稳定转染和瞬时转染。 稳定转染是指外源基因（DNA/RNA）整合到宿主基因组上，并能稳定遗传给后代，这多用于长期观察基因对于细胞功能的影响以及蛋白之间的相互作用。 瞬时转染则是指外源基因（DNA/RNA）不整合到宿主基因组上，仅在细胞分裂周期内表达，主要用于启动子和其他调控原件的分析以及蛋白质的功能研究。 两者的实验步骤相似，但在实验操作上有一定的差异。 首先，稳定转染和瞬时转染所使用的转染试剂不同。稳定转染通常使用脂质体等试剂，通过细胞内吞作用将外源基因整合到细胞基因组中。这些试剂可以促进外源基因与细胞表面的受体结合，从而实现基因的稳定转染。而瞬时转染则是使用聚凝胺等试剂进行转染，虽然这些试剂也可以促进外源基因进入细胞，但它们不会将基因整合到细胞基因组中。 其次，稳定转染和瞬时转染对外源基因的要求也不同。稳定转染通常需要使用具有复制能力的质粒或病毒载体，以便外源基因可以在细胞内稳定存在并整合到细胞基因组中。而瞬时转染则不需要使用具有复制能力的载体，因为外源基因只是短暂地表达，拷贝数会被稀释，无法达到持续表达外源基因的目的。 根据转染试剂的不同，可分为：化学转染、物理转染、病毒转染。 化学转染：通过使用一些化学物质，如聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体等，来改变细胞膜的物理和化学性质，使其对外源性DNA或RNA具有亲和力，从而实现基因转移。这种方法的优点在于可以通过控制化学物质的浓度和作用时间等因素来精确控制转染的效率和时间。 物理转染：包括基因枪法和电击法。基因枪法利用高速运动的粒子，将DNA或RNA撞击到细胞膜上，从而进入细胞。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入（实验条件控制较严、难度较大）。物理转染的优点在于可以直接将DNA或RNA导入到细胞内，而不需要使用任何化学物质。 病毒转染：利用病毒作为载体，将外源基因包装后导入细胞。这种方法可以有效地实现外源基因的稳定整合和表达，同时具有较高的转染效率和安全性。常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒等。病毒转染的优点在于可以实现高效、特异性的基因转移，同时避免使用某些化学物质对细胞产生的负面影响。 四、转染应用场景 1.在生命科学研究领域，转染技术的主要应用包括： 基因功能研究：通过转染技术将外源基因导入细胞，研究该基因在细胞中的功能、表达调控、亚细胞定位等。 基因敲除和沉默：通过转染技术导入含有特定基因敲除或沉默序列的质粒，研究特定基因的敲除或沉默对细胞生长、分化、凋亡等的影响。 病毒感染研究：将病毒基因导入细胞系，研究病毒感染细胞的机制、抗病毒药物的作用机理等。 细胞分化和命运决定：通过转染技术导入与细胞分化命运相关的基因或调控元件，研究细胞的分化、凋亡、自噬等过程。 肿瘤研究：将与肿瘤相关的基因导入肿瘤细胞系，研究肿瘤细胞的恶性转化、肿瘤耐药性、肿瘤免疫等。 2.在药物研发和生产中，转染技术的主要应用包括： 疫苗生产：将病毒抗原基因导入合适的细胞系，通过转染技术获得可表达病毒抗原的细胞系，用于制备疫苗。例如，将病毒抗原基因导入昆虫细胞中，可以生产出高效、安全的病毒疫苗。 基因治疗：将治疗性基因（如治疗性siRNA、质粒DNA等）导入靶细胞，通过转染技术实现基因治疗。例如，将特定基因导入心肌细胞中，可以治疗遗传性心脏病或心肌梗死等疾病。 药物筛选：通过转染技术将药物靶点基因导入细胞系，用于筛选能够与药物靶点结合的药物候选物。 生产细胞系：在生产重组蛋白药物、抗体药物等过程中，通过转染技术将目的基因导入生产细胞系，获得可稳定表达目的药物的细胞系。 总之，转染技术在生命科学研究领域和药物研发、新药开发等领域具有广泛的应用前景，为研究基因功能、疾病治疗和新药开发提供了有效的工具和方法。 五、转染步骤 1.以下是较为常见的一种转染方法的步骤：
☆ 准备细胞：选择适当类型的细胞进行转染，并在转染前进行适当的培养，确保细胞处于对转染最有利的状态。 ☆ 准备基因：将目的基因以合适的方式进行剪切和标记，以便于后续的检测和筛选。 ☆ 制备转染载体：选择适当的转染载体，如脂质体、病毒等，将目的基因包裹在转染载体中（这个步骤是载体构建，将目的基因插入到转染载体中，形成重组目的基因片段，并利用这种重组片段转染目标细胞，从而将目的基因导入细胞中） ☆ 进行转染：按照生产商提供的标准操作流程，将转染载体导入受体细胞。 ☆ 确认转染效果：通过特定的检测方法，如荧光染色、免疫细胞化学、Western blot等，确认目的基因是否成功转入受体细胞中。 ☆ 筛选和克隆：对于需要进一步克隆和扩增的细胞，可以通过特定的筛选方法，如抗生素筛选、荧光筛选等，对细胞进行筛选和克隆。 ☆ 扩大培养：将筛选出的细胞进行扩大培养，以便获得更多的细胞用于后续的实验或生产。 ☆ 功能验证：在进行基因转染后，需要通过特定的功能验证方法，如ELISA、细胞活性检测、Western blot等，确认目的基因是否成功表达并发挥作用。 注意：转染载体是指在基因转染过程中，用于帮助目的基因进入宿主细胞的一些辅助因子。这些载体可以是质粒、病毒、人工染色体或其他能自主复制的DNA分子。 在转染过程中，目的基因通常被插入到载体中，以便于将其导入宿主细胞。载体可以将目的基因带到细胞内部，并确保其在细胞内稳定存在和表达。常见的转染载体包括质粒、噬菌体、反转录病毒、慢病毒等。 其中，质粒是最常用的一种转染载体，它是一种小型环状DNA分子，可以在细胞内自主复制。噬菌体则是一种病毒，它能够将其遗传物质插入到细菌细胞中，并利用细菌的细胞器进行自我复制。反转录病毒和慢病毒则可以感染哺乳动物细胞，将外源性基因导入细胞内进行表达。 2.siRNA转染步骤 ① 以下是siRNA转染至受体细胞的步骤：
☆ 设计siRNA：首先，需要基于目标基因序列设计siRNA。可以使用在线工具或商业实验室进行设计（Like us）。一般建议设计2-3条siRNA并进行验证，以确保特异性和有效性。 ☆ 合成siRNA：将设计好的siRNA通过化学合成方法制备出来，并进行纯化和浓缩。通常选择购买现成的siRNA（We have what you want），也可以使用自行合成的siRNA。 ☆ 细胞培养：将所需的受体细胞培养到适当的数量和密度。在转染前应确保细胞处于快速增长期，并且细胞状态良好。 ☆ 转染siRNA：根据转染试剂说明书或实验室标准操作流程，将siRNA转染到受体细胞中。☆ 鉴定：转染后需要对细胞进行恢复培养，通常24-48小时后可以进行下一步操作。 ② siRNA概念及转染作用 siRNA，即小干扰RNA，是一种长度约为21-25个核苷酸的双链RNA分子。 在转染这一步骤中，siRNA发挥的作用是诱导靶基因的沉默，进而抑制蛋白的表达。具体来说，当siRNA进入细胞后，它能够与细胞内的mRNA（信使RNA）结合，导致信使RNA的降解，从而阻止特定蛋白质的翻译。由于这种机制，siRNA在基因治疗和药物研发中具有广泛的应用前景，包括但不限于基因沉默、基因敲除、基因修饰、病毒抑制、细胞治疗以及疫苗研发等。 3.其余转染的基因类型 ① miRNA的概念及转染作用 miRNA是一种非编码RNA，它通常由约20-25个核苷酸组成，并在真核生物中广泛存在。miRNA的主要功能是在细胞中调节基因表达。它们通过与靶标mRNA相结合，引发一系列的生物学过程，如抑制mRNA的翻译或促进mRNA的降解。通过这种方式，miRNA能够对多种基因的表达进行精确的调控，影响细胞的生长、分化、代谢和发育等重要过程。 在转染至受体细胞中，miRNA的作用主要是调节特定基因的表达。它们通过与靶mRNA结合，影响转录后基因表达的效率。具体而言，miRNA可以促进靶mRNA的降解，从而降低特定基因的表达水平；也可以抑制靶mRNA的翻译，进一步减少特定基因的蛋白质产物。通过这些方式，miRNA能够精细地调控细胞内的基因表达过程。 miRNA在许多生物学过程中发挥重要作用，包括细胞周期调控、细胞分化、免疫应答、发育调节等。同时，异常的miRNA表达与多种疾病的发生和发展相关，如癌症、心血管疾病、神经系统疾病等。因此，miRNA在生物学和医学研究中具有重要的价值和潜在的临床应用前景。 ② mRNA概念及转染作用 mRNA，全称为信使RNA，是由DNA上的基因信息转录而来的一种核酸分子。在细胞内，mRNA负责将DNA上的遗传信息转录成可读取的RNA序列，并传递给核糖体，以便合成蛋白质。 mRNA的转染作用是指将体外合成的mRNA通过某种方式导入到细胞内，利用细胞内的翻译系统将mRNA翻译成目标蛋白质。这种技术被广泛应用于生物医药领域，如mRNA疫苗的研发和mRNA药物的生产。 通过mRNA疫苗的研发，可以让人体免疫系统产生对病毒的免疫力，达到预防病毒感染的目的。此外，利用mRNA编程的细胞外包装体可以用来治疗癌症等疾病。这些外表皮体可以将mRNA输送到病变区域，从而激活免疫系统并促进治疗的效果。 在转染过程中，mRNA需要被加工和修饰，以确保其稳定性、蛋白质表达效率和正确的亚细胞定位。这些加工过程包括5'端帽子修饰、3'端多聚腺苷酸尾巴的形成等。 相较于其他技术如蛋白质技术、基因组编辑技术等，mRNA技术具有高效性、安全性、制备简单、生产周期短、成本低等优点。因此，基于mRNA技术开发的各种疫苗及药物将会是生物医药产业的发展方向。 六、常用于转染的细胞 常用于转染的细胞包括原代细胞、原代细胞衍生物、肿瘤细胞系、幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、人胚肾细胞（HEK-293）、人胚肺细胞（HEL）、人肺癌细胞（A549）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人宫颈癌细胞（HeLa）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、大鼠肝细胞、神经元细胞等。 人胚胎肾细胞（HEK293）：这种细胞系具有高转染效率和稳定性的特点，常用于基因克隆和疫苗生产。 人宫颈癌细胞（HeLa）：这种细胞系具有高分裂速度和稳定性的特点，常用于基因功能研究和蛋白质生产。 人骨髓瘤细胞（U266）：这种细胞系具有高分化度和稳定性的特点，常用于基因克隆和药物筛选。 小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）：这种细胞系具有低免疫原性和高分裂速度的特点，常用于基因敲除和药物筛选。 大鼠胶质瘤细胞（C6）：这种细胞系具有高分化度和稳定性的特点，常用于药物筛选和肿瘤研究。 需要注意的是，不同的细胞类型具有不同的转染效率和特点，实验人员需要根据具体实验需求和细胞特点选择适合的转染方法和技术。 七、转染常用试剂推荐
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