  上海欣软《动物行为实验手册》正在免费包邮发放中，《动物行为实验指南》是前者的进阶篇，全书约680页，内容极尽详实，印书版排版已结束，获取方式请关注公众号：脑声常谈的后续通知。  运动是改善非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的有效非药物策略，但其潜在机制有待进一步研究。半胱氨酸双加氧酶1 ( Cysteine dioxygenase 1, Cdo1)是半胱氨酸分解代谢的关键酶，在肝脏中富集，其在NAFLD中的作用目前尚不清楚。 基于此，2023年12月18日上海体育大学郭亮研究团队在Nature communications杂志发表了“Cdo1-Camkk2-AMPK axis confers the protective effects of exercise against NAFLD in mice”揭示了Cdo1-Camkk2-AMPK轴赋予了运动对小鼠NAFLD的保护作用。
在这里，作者发现运动通过cAMP/PKA/CREB信号通路诱导肝脏Cdo1的表达。肝细胞特异性敲除Cdo1降低了小鼠的基础代谢率，损害了运动对NAFLD的影响，而肝细胞特异性过表达Cdo1增加了小鼠的基础代谢率，并与运动协同改善NAFLD。在机制上，Cdo1通过与Camkk2相互作用，将它们连接到AMPK上，从而激活AMPK信号。这促进肝细胞中脂肪酸氧化和线粒体生物发生，以减轻肝骨化。因此，Cdo1通过促进肝脏Camkk2-AMPK信号通路，作为运动对抗NAFLD的重要下游效应因子。
图一 在小鼠运动过程中，肝脏Cdo1通过cAMP/PKA/CREB通路被诱导 作者首先探究了运动对Cdo1表达的影响，野生型C57BL/6小鼠喂食饲料接受有氧运动8周，并发现运动后Cdo1在肝脏的表达可以显著上调。cAMP作为一种运动反应因子，可以通过蛋白激酶A激活cAMP反应元件结合蛋白，从而促进靶基因的转录。运动增加了肝脏中cAMP的含量，并显著增加了CREB的磷酸化水平。由于CREB是一种转录因子，因此作者研究了CREB在Cdo1表达中的转录作用。染色质免疫共沉淀数据显示，CREB可以与Cdo1的启动子结合。在Cdo1启动子的基因组区域发现了一个CREB结合序列，表明Cdo1的转录可能受到CREB的直接调控。然后作者构建了Cdo1启动子荧光素酶报告基因，发现CREB以剂量依赖性的方式增强了荧光素酶的活性。此外，原代肝细胞和HepG2细胞经Forskolin处理后，Cdo1 mRNA和蛋白水平显著上调。这些结果表明，运动可通过cAMP/PKA/CREB通路诱导肝脏Cdo1。
图二 肝细胞特异性敲除Cdo1可损害运动介导的小鼠脂肪肝缓解 与饲料饮食喂养的小鼠相比，高脂肪饮食喂养的小鼠肝脏中Cdo1的表达显著降低。此外，与非NAFLD患者相比，NAFLD患者的肝脏CDO1也显著降低。此外，高脂饮食诱导的NAFLD小鼠的肝脏Cdo1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于对照组饮食喂养的小鼠。作者运用肝脏特异性Cdo1敲除小鼠和对照Cdo1flox/flox小鼠，HFD喂养16周构建NAFLD模型。从HFD喂养的第9周开始，小鼠在啮齿类动物中进行为期8周的运动方案，在跑步机上进行了增量负荷的运动测试。结果发现，8周的运动训练提高了小鼠的运动能力。与非运动组小鼠相比，运动显著降低了小鼠的体重增加、肝脏重量。与WT/Sed小鼠相比，WT/训练小鼠表现出更高的糖耐量和胰岛素敏感性，血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平较低。然而，Cdo1LKO导致了更严重的脂肪肝表型，减弱了运动在减少体重增加方面的作用，并减轻了饮食诱导的小鼠肝脂肪变性和相关代谢紊乱。Cdo1LKO并不影响小鼠的食物摄入量和身体活动。由于胰岛素敏感性受到Cdo1LKO和运动训练的影响，作者进一步检测了HFD小鼠肝脏中胰岛素刺激的Akt-Ser473磷酸化。运动增强了胰岛素诱导的Akt肝脏中的磷酸化，Cdo1可以代谢半胱氨酸生成牛磺酸。因此，继续检测了肝脏中半胱氨酸和牛磺酸的水平，发现运动和Cdo1LKO均未显著影响肝脏半胱氨酸和牛磺酸的水平。推测在肝脏中特异性敲除Cdo1后，Cdo1也存在于其他组织中，可能在半胱氨酸的代谢中起代偿作用。上述结果表明，肝脏Cdo1在运动介导的小鼠NAFLD缓解中发挥了重要作用。
图三 Cdo1调控的AMPK信号通路参与了运动介导的小鼠脂肪肝的减轻 接下来，作者进行了RNA测序研究小鼠肝脏中CKO1影响的关键信号通路，以探索在HFD喂养条件下，野生型和Cdo1LKO小鼠肝脏中的差异表达基因。与对照组相比，Cdo1LKO小鼠样本中共有630个基因显著上调，672个基因显著下调。DEGs在几个生物过程中富集，包括阳性脂质代谢和线粒体呼吸链复合体组装的调节。这表明Cdo1可能调节脂肪酸的代谢和线粒体的生物合成。进一步的研究表明，Cdo1LKO抑制了小鼠肝脏中一些重要的FAO基因和线粒体生物合成基因的表达。Cdo1LKO也降低了小鼠肝脏线粒体DNA拷贝数。然而，与脂肪生成相关的基因不受Cdo1LKO的影响。此外，运动可以促进FAO基因和线粒体生物合成基因的表达，上调肝脏线粒体DNA拷贝数，但这些作用均被Cdo1LKO减弱，Cdo1LKO引起线粒体的肿胀和破裂。这些上调基因丰富的各种途径，包括核因子kappaB信号通路。免疫印迹结果显示，运动后磷酸化的-AMPKα水平升高，但Cdo1LKO消除了这种作用。AMPK可促进线粒体生物合成和FAO基因的表达，从而减轻肝细胞脂肪变性。此外，AMPK信号通路被认为是通过运动缓解NAFLD的关键途径。因此，肝脏Cdo1可促进FAO和线粒体生物发生，抑制肝脏脂肪变性，其中AMPK信号通路可能参与其中。
图四 肝细胞特异性过度表达Cdo1(Cdo1LTG)和运动可协同缓解小鼠 NAFLD 作者最后研究了Cdo1促进AMPK信号转导的机制，用含有编码flag标记Cdo1基因的腺病毒感染原代肝细胞，并使用抗flag抗体对细胞裂解液进行共免疫沉淀，然后进行免疫印迹检测。LKB1和Camkk2是磷酸化和激活AMPKα的两个主要上游激酶。Cdo1可以同时与Camkk2和AMPKα相互作用，但不能与LKB1相互作用。同样，作者发现Cdo1Y157F也可以与原代肝细胞中的AMPKα和Camkk2相互作用。共聚焦分析显示，在Hepa1-6和HEK293T细胞中，ᾏ1WT和Flag-Cdo1Y157F可以与HA-Camkk2共定位。此外，在内源性水平上，Camkk2也可以与Cdo1以及AMPKα相互作用。这些数据表明，Cdo1、Camkk2和AMPKα可以在同一复合体中共存。然后作者研究了Cdo1是否能促进原代肝细胞中AMPKα和Camkk2的关联。结果发现，过表达Cdo1WT或Cdo1Y157F促进了AMPKα与Camkk2的相互作用，敲除Cdo1显著减弱了AMPKα与Camkk2的相互作用。此外，作者还利用重组的Cdo1、Camkk2和AMPK蛋白进行了体外无细胞重组实验，发现Cdo1也促进了camkk2诱导的AMPKαThr172磷酸化。原代肝细胞中Camkk2的敲除削弱了Cdo1过表达介导的Thr172上AMPK磷酸化的激活。相比之下，LKB1的敲除对Cdo1过表达介导的Thr172上AMPK磷酸化的激活影响很小。这些数据表明，Cdo1在促进AMPK激活中的作用中所需要的是Camkk2，而不是LKB1。这些结果表明，Cdo1可以通过与Camkk2相互作用，促进其与AMPK的关联，从而促进Camkk2介导的AMPK磷酸化。 总之，作者的数据表明，运动可以通过cAMP/PKA/CREB信号通路促进肝脏Cdo1的表达，肝源性Cdo1在运动治疗减轻小鼠肝脂肪变性中起着重要作用。肝脏Cdo1和运动可以在一定程度上协同缓解脂肪肝涉及Cdo1-Camkk2-AMPK轴。该研究结果提供了证据表明肝脏Cdo1可能是运动预防和治疗NAFLD的重要下游效应器。  https:///10.1038/s41467-023-44242-7   特别鸣谢 |
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