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方法一：SDS-PAGE SDS-PAGE可以将样品中的蛋白质（通常是细胞或组织裂解物）按大小分离，因为缓冲液和凝胶中带负电荷的SDS均匀地对所有氨基酸施加负电荷，从而能够在电场中根据大小而不是根据其独特的氨基酸含量和电荷分离蛋白质。然后可以用考马斯蓝或银染色对蛋白质进行可视化。值得注意的是，带有考马斯蓝或银染色的SDS-PAGE可用于检测一些磷酸化蛋白，磷酸化导致蛋白质的迁移速度慢于未磷酸化的蛋白质。这种方法的一个明显缺点是无法消除由于其他因素（例如糖基化）引起的迁移速度改变。由于所有蛋白质都被染色，因此SDS-PAGE主要是对纯化的蛋白质进行磷酸化分析。 方法二：WB 蛋白质免疫印迹法是定性测量蛋白质磷酸化水平的金标准。通过SDS-PAGE分离蛋白质后，当施加电压时，蛋白质从凝胶转移到膜上。通过将识别目标蛋白质磷酸化的抗体添加到膜中。然后，磷酸化抗体与辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的二抗结合。当添加HRP底物时，可以检测到抗体结合了磷酸化的蛋白质，从而产生化学发光。 蛋白质印迹的灵敏度和特异性取决于所使用的抗体。如果抗体与样品中的其他蛋白质非特异性结合，则与蛋白质分子量标准相比，蛋白质的分子量和迁移模式通常有助于确定哪个条带是目标蛋白。然而，如果抗体与具有相似重量的多种蛋白质亚型结合，这可能会有问题。如前所述，磷酸化蛋白的迁移可能与预期不同。 通过肉眼比较不同样品免疫印迹处理的条带强度的相对差异，但可以提取密度测量信号以获得半定量数据。基于荧光的蛋白质印迹使用荧光偶联检测抗体，是定量分析和同时检测多种蛋白质的首选方法。采用蛋白质印迹法的磷酸化研究应至少包括管家基因、磷酸化蛋白和总蛋白的表达水平分析。
WB检测蛋白质磷酸化步骤（图片来源于www.raybiotech.com） 方法三：流式细胞术 流式细胞术是一种基于液体的方法，其中使用靶向特定目标蛋白的荧光偶联抗体对单细胞进行表征。流式细胞术也可以测量细胞活力。抗体荧光团获得的平均荧光强度（MFI）与目标蛋白的数量成正比;因此，MFI越高，抗原水平越高。流式细胞术主要用于检测细胞表面蛋白;然而，也可以分析细胞内蛋白质，如磷酸化蛋白质。未染色的细胞或用相同的荧光团偶联对照抗体染色的细胞应用作阴性对照，以帮助确定所选抗体的自发荧光和非特异性结合。另一个阴性对照是“同型对照”，其中细胞被靶向目标蛋白的抗体染色。同型对照可确保磷酸化抗体的 MFI 对目标磷酸化蛋白具有特异性，而不是伪影。通过流式细胞术获得准确的细胞计数和相对倍数变化。
流式检测蛋白质磷酸化步骤（图片来源于www.raybiotech.com） 方法四：酶活性分析 激酶活性可以通过体外激酶活性测定法测定，其中纯化的激酶和未磷酸化的底物与放射性标记的ATP混合在一起，随后通过放射性标记的磷酰基分析底物的磷酸化。闪烁计数与磷酸化底物的量成正比。其他体外激酶检测不使用放射性标记的 ATP，而是使用对 ADP 具有特异性的检测抗体（例如 Adapta™）或磷酸化的目标位点。主题的另一个变体是时间分辨荧光共振能量转移 （TR-FRET），它使用称为“示踪剂”的荧光 ATP 分子和成对的荧光标记抗激酶抗体。在没有底物的情况下，抗体和示踪剂将产生TR-FRET信号。当激酶用ATP示踪剂更多地磷酸化底物时，TR-FRET信号会降低。这种研究方法通常被药物开发人员用于鉴定新的激酶底物或筛选小分子激酶抑制剂。 方法五：ELISA 传统的基于夹心的ELISA使用两种抗体来检测目标蛋白：一种抗体捕获目标蛋白，而另一种抗体用于检测目标蛋白。为了使用 ELISA 检测磷酸化蛋白，一种抗体结合总蛋白，而另一种抗体结合磷酸化位点;最佳捕获/检测配置必须由ELISA显影剂根据经验确定。简而言之，固定在 96 孔板上的捕获抗体在应用样品时与目标蛋白结合。随后 HRP 偶联的检测抗体结合导致目标蛋白被“夹”在两种抗体之间。当 HRP 与其添加的底物反应时会产生蓝色，并且通过添加硫酸停止该反应，硫酸将颜色从黄色变为蓝色。450 nm处的吸光度水平（即光密度，OD）与检测到的目标蛋白的量成正比。
双抗体夹心法ELISA示意图（图片来源于www.raybiotech.com） 目标蛋白的浓度通过标准曲线确定，该曲线是通过添加已知量的纯化靶标产生的。虽然传统的 ELISA 是定量的，但大多数磷酸化 ELISA 是半定量的，因为它们不使用纯化的磷酸化蛋白或肽来创建标准曲线。相反，含有目标磷酸化蛋白的细胞裂解物用作阳性对照，以确定仪器的线性OD范围;不生成标准曲线。幸运的是，更多的定量磷酸化ELISA正在商业化。
免疫探针和双抗体夹心法ELISA比较（图片来源于www.raybiotech.com） 方法六：抗体芯片 通过使用基于夹心的抗体芯片，可以对磷酸化蛋白进行多重检测，其中抗体固定在玻璃、膜或磁珠上。在封闭步骤之后，将样品与芯片一起孵育。然后洗去非特异性蛋白质，并将芯片与检测抗体一起孵育，从而进行化学发光或荧光分析。信号与抗体结合的蛋白质量成正比。蛋白质印迹、ELISA和抗体芯片数据之间的比较表明，当用PDGFβ处理NIH3T3细胞时，所有三种方法都反映了相似的磷酸化变化。虽然抗体芯片可以获得定量数据，但市面上没有靶向磷酸化蛋白的定量芯片。通过以可寻址的形式发现或标记不同的抗体，蛋白质鉴定非常简单。
与未经处理或经PDGFβ处理的NIH3T3细胞裂解物一起孵育的磷酸化抗体芯片（图片来源于www.raybiotech.com） 方法七：质谱 在常见的“自下而上”MS方法中，蛋白质被消化成肽，然后在质谱分析之前将其电离。使用编译的肽对蛋白质数据库，根据其质量和片段化将每个肽分配给蛋白质。在检测过程中，低丰度蛋白（例如磷酸化蛋白）的检测可能会被高丰度蛋白所掩盖。因此，在MS分析之前，磷酸化肽的富集通常使用磷酸化特异性抗体或二氧化钛进行。根据上游样品制备和基质的不同，单次分析可使用 MS 鉴定 5,000 多种蛋白质。无论磷酸化状态如何，都可以使用MS获得半定量（相对倍数变化）和定量数据（蛋白质浓度）。与蛋白质印迹和ELISA相比，MS有三个明显的区别。首先，可以识别新的磷酸化事件，因为MS不依赖于抗体。这种类型的分析被认为是“无假设”或“无偏见”。其次，蛋白质印迹和 ELISA 的动态范围很窄，为 2–3个数量级，而 MS 的动态范围高达5个数量级，因此能够在较低浓度下检测磷酸化蛋白。最后，蛋白质亚型可以很容易地相互区分。 |
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