|
题目：WUSCHEL-related homeobox transcription factor SlWOX13 regulates tomato fruit ripening 刊名：Plant Physiology 作者：Yueming Jiang, Xuewu Duan et al. 单位：South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 日期：23 November 2023    01 摘要  果实成熟是一个复杂的遗传程序过程，涉及关键转录因子（TF）的作用。尽管WUSCHEL相关同源盒（WOX）转录因子在植物发育中具有既定的重要性，但WOX及其在果实成熟调节中的潜在机制仍不清楚。 在这里，我们证明了SlWOX13调节番茄（Solanum lycopersicum）的果实成熟。SlWOX13的过表达加速了果实的成熟，而SlWOX113的功能缺失突变延缓了这一过程。此外，乙烯合成和类胡萝卜素积累在slwox13突变体果实中显著抑制，但在slwox13转基因果实中加速。 RNA-seq和染色质免疫沉淀（ChIP）-seq的综合分析确定了422个SlWOX13的直接靶点，其中243个基因受到SlWOX13。电泳迁移率转移测定、RT-qPCR、双荧光素酶报告基因测定和ChIP-qPCR分析表明，SlWOX13直接激活参与乙烯合成、信号传导和类胡萝卜素生物合成的几个基因的表达。此外，SlWOX13通过关键的成熟相关转录因子调节番茄果实成熟，如成熟抑制剂（RIN）、非成熟抑制剂（NOR）和NAM、ATAF1、2和CUC2 4（NAC4）。因此，这些作用促进了果实的成熟。总之，这些结果表明，SlWOX13通过乙烯合成和信号传导以及通过关键成熟相关转录因子的转录调节，正向调节番茄果实成熟。 02 技术路线  wheat cv Suwon 11 and Fielder, and tobacco Nicotianabenthamiana were used in this study Signal peptide validation Subcellular localization of PstGTA1 Transcriptional activation analysis in yeast Generation and identification of wheat transgenic plants Dual-luciferase reporter assay Chromatin immunoprecipitation and ChIP-qPCR 03 主要结果 3.1 SlWOX13在番茄中表现出成熟相关表达模式 基于先前的蛋白质组学研究，从番茄果实中分离出一个WOX基因（Solyc02g082670），命名为WOX14。这种WOX在转录物和蛋白质水平上表现出成熟相关的表达模式。氨基酸序列比对和系统发育分析表明，WOX14与AtWOX13同源（图1A），参与复制子形成的调控。这些结果表明WOX14可能参与果实发育或成熟的调控。 在本研究中，我们将该基因重新命名为SlWOX13。亚细胞定位分析显示，SlWOX13仅定位在细胞核中（图1B）与其在转录调控中的假定作用一致。为了研究SlWOX13的生理重要性，我们首先检测了SlWOX13-在各种番茄组织中的表达模式。尽管在所有器官中都检测到SlWOX13的表达，但它在茎、花和成熟果实中的积累更高（图1C）。 随着果实成熟的进行，SlWOX13的表达显著上调（图1C）。此外，SlWOX13转录物被外源乙烯显著诱导，但被乙烯作用抑制剂1-MCP抑制（图1D）。此外，转录活性测定显示，与pBD载体的阴性对照相比，SlWOX13显著激活LUC报告基因的表达（图1E）。这些结果表明，SlWOX13可能在果实成熟的启动或进展中发挥积极作用。
3.2 SlWOX13促进果实成熟 为了深入了解SlWOX13可能参与果实成熟的调控，我们使用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了功能缺失的SlWOX13-突变体，其中两个sgRNA特异性靶向SlWOX1-3的第一个外显子。分离出两个slwox13突变体，slwox13-12和slwox13-28，第一个外显子中有纯合的1-bp缺失，产生预测的2.5kD截短蛋白。slwox13-28突变体还携带由靶sgRNA2引起的额外3-bp缺失。此外，产生了24个稳定的SlWOX13转基因系。选择两个独立的转基因系，SlWOX13-2和SlWOX13-4，具有高表达水平的SlWOX13基因和SlWOX13蛋白，用于进一步分析。表型分析表明，slwox13突变果实表现出延迟果实成熟表型（平均2.5 d），而稳定过表达SlWOX13加速了果实成熟（平均3.5 d）（图2A）。在番茄果实成熟过程中，野生型果实的乙烯生成速率先增加后降低，而类胡萝卜素则不断积累。SlWOX13的过表达加速了乙烯的产生和类胡萝卜素的积累（图2B和2C），然而，在番茄成熟过程中，SlWOX13突变体表现出相反的模式。此外，在SlWOX13转基因果实中，乙烯生物合成相关基因如ACC合成酶（ACS2）和ACC氧化酶（ACO3）的表达，以及细胞壁降解相关基因，包括纤维素酶（CEL2）和内-1,4-β-甘露聚糖酶（MAN4）的表达在早熟过程中上调（图2D）。总之，这些数据表明SlWOX13在番茄果实成熟过程中起到增强作用。
图2:SlWOX13促进番茄果实成熟。 （A） 在果实成熟过程中，WT系、SlWOX13转基因系SlWOX13-2和SlWOX13-4以及SlWOX13敲除突变系SlWOX13-12和SlWOX13-28的果实表型。 （B） WT、slwox13突变体和slwox13转基因系果实中的乙烯生产速率。 （C） 野生型、slwox13突变体和slwox13转基因系果实中番茄红素含量。 （D） 在果实成熟过程中，WT、slwox13突变体和slwox13转基因系果实中成熟相关基因的表达。 3.3 SlWOX13调节成熟相关基因的表达 为了阐明SlWOX13调节果实成熟的机制，我们对处于两个不同阶段的野生型果实进行了比较转录组分析：39 dpa和42 dpa。此外，我们比较了WT和slwox13-12果实在42dpa时的转录组，分别对应于BR和MG阶段。我们共鉴定了6682个基因，这些基因在野生型果实的MG和BR阶段之间表现出显著的表达差异。这些差异表达基因（DEG）被称为成熟相关基因。类似地，我们鉴定了6831个基因，这些基因在42 dpa时在slwox13-12和WT果实之间表现出显著的表达差异。这些DEG被指定为SlWOX13调控基因。成熟相关基因和SlWOX13调节基因之间的重叠显示85.9%（6682中的5743）的成熟相关基因受SlWOX13。在这5743个由SlWOX13调节的基因中，与野生型水果相比，在SlWOX13-12水果中，59.0%（3388个基因）上调，而41.0%（2355个基因）下调（图3A）。这表明SlWOX13在调节成熟相关基因的转录中起作用。 GO富集分析表明，slwox13-12果实中上调的基因富集于膜和细胞壁组织的组成部分（图3B）。另一方面，下调的基因在氧化还原酶活性、水解酶活性、果实成熟、乙烯生物合成过程、类胡萝卜素生物合成过程中高度富集（图3C）。此外，与野生型水果相比，slwox13-12水果中参与成熟相关过程的大量基因，如表观遗传和转录调节、乙烯生物合成、受体和信号转导、细胞壁降解、叶绿素降解和类胡萝卜素生物合成，均下调。此外，主成分分析（PCA）表明，slwox13果实落后于野生型成熟过程，而SLWOX13OE系领先于这一过程（图3D）。 RT-qPCR分析进一步证实了RNA-seq数据的可靠性。选择了10个果实成熟相关基因和2个ABA生物合成相关NAC-TFs的表达。ACC合成酶（ACS4）、PECTATE LYASE（PL）、β-半乳糖苷酶4（TBG4）、聚半乳糖醛酸酶（PG2a）、FUL1、DML2、甲基亚砜还原酶A4（E4）、NAC-TFs（TAF1、JA2）在SlWOX13转基因果实中与野生型果实相比被证实上调，乙烯反应因子（ERF.H1）和HD-ZIP同源盒蛋白（HB-1）下调（图3E）。总之，这些结果表明SlWOX13通过调节成熟相关基因的转录来调节番茄果实的成熟
图3。SlWOX13调节番茄果实成熟相关基因的表达。 （A） SlWOX13共调控成熟相关基因的层次聚类分析。 （B，C）与野生型果实相比，SlWOX13果实中调节成熟相关的上调（B）和下调（C）基因的GO富集分析。 （D） 39 dpa和42 dpa时不同基因型转录组的主成分分析。 （E） 通过RT-qPCR验证RNAseq数据。 3.4 番茄果实成熟过程中SlWOX13靶基因的全基因组鉴定 为了进一步研究SlWOX13在果实成熟中的调节作用，使用ChIP-Seq方法在全基因组范围内调查了SlWOX12的直接靶基因。从39 dpa的SlWOX13-4转基因系收获果实用于染色质提取，然后用抗GFP抗体免疫沉淀。使用IgG抗体作为阴性对照。从三个生物重复中总共获得8469个重叠峰，这些重叠峰被认为是高置信度SlWOX13结合峰，并用于进一步分析。生物信息学分析显示，SlWOX13与各种基因组片段结合，包括启动子、TTS、基因间区域、外显子和内含子（图4A）。值得注意的是，SlWOX13的36.57%的DNA结合位点主要位于启动子内（图4A），与SlWOX12是具有DNA结合和基因调控活性的典型TF一致。 为了对SlWOX13的DNA结合特性有更多的了解，在我们的ChIP-Seq分析中使用MEME程序鉴定的SlWOX13-结合区的基础上进行了从头基序预测。这一分析导致了两个基序的鉴定，即C（G/C）（G/A）TGATG（G/T）C和（G/A。这些由SlWOX13结合的DNA序列与先前报道的WOX识别基序（TAAT）略有不同。研究表明，除了经典结合基序外，WOX转录因子还可以识别其他序列，如G-box或TGA（A/T）基序。这表明，在体内精确选择每种WOX蛋白的靶基因启动子序列除了需要DNA序列之外，还需要其他因素。作为一种转录因子，SlWOX13通过与启动子区域结合来调节基因表达。因此，为了鉴定SlWOX13的直接靶基因，我们将重点放在位于从转录起始位点开始的3kb上游区域内的ChIP-seq峰上。共鉴定出3101个重叠峰，对应于2654个基因，并被认为是潜在的SlWOX13直接靶标。 为了研究SlWOX13结合基因在番茄果实成熟过程中的表达模式，我们对ChIP-Seq和RNA-Seq数据进行了综合分析。鉴定出422个重叠基因（图4C），它们被认为是SlWOX13靶向成熟相关基因。我们进一步关注通过RNA-seq数据的成对比较鉴定的SlWOX13靶向成熟相关基因。在422个成熟相关基因中，179个（42.42%）被SlWOX13上调，证实了SlWOX12主要作为果实成熟的转录激活因子发挥作用，而243个（57.58%）被SlWOX13下调（图4C）。基因功能分类分析表明，推定的SlWOX13靶向成熟相关基因主要参与水解酶活性、激素活性、乙烯生物合成过程和果实成熟（图4D）。此外，许多基因与转录调控（RIN、NOR、NAC4、JA2和TAF1）、类胡萝卜素生物合成[植物烯合成酶1（PSY1）、植物烯脱饱和酶（PDS）和β-胡萝卜素羟化酶（BCH）、乙烯生物合成、，受体和信号传导[ACO1、乙烯受体4（ETR4）、乙烯不敏感E3样基因1（EIL1）、乙烯反应因子（ERF.B3）]被SlWOX13直接结合和激活。这些数据表明，SlWOX13通过直接激活成熟相关基因的表达，正向调节番茄果实成熟
3.5 SlWOX13在果实成熟过程中直接激活乙烯生物合成和信号传导基因的表达 先前的研究表明，乙烯在番茄果实成熟的调节中起着关键作用。基于我们的ChIP-Seq数据，我们发现一些报道的乙烯合成和信号传导相关基因，如ACO1、ETR4、EIL1和ERF。B3用抗GFP抗体免疫沉淀。因此，我们假设SlWOX13可能通过直接调节乙烯生物合成和信号传导相关基因来促进果实成熟。为了测试这种可能性，我们首先在体外和体内检测了SlWOX13蛋白是否直接结合乙烯生物合成（ACO1）、受体（ETR4）和信号传导（EIL1和ERF.B3）基因的启动子区。正如预期的那样，EMSA和ChIP-qPCR结果表明，SlWOX13可以直接与ACO1、ETR4、EIL1和ERF的启动子结合。B3（图5A）。 为了进一步验证这一假设，进行了双荧光素酶报告基因（DLR）测定。如图5A（iii）-5D（iii）所示，ACO1、ETR4、EIL1和ERF的活性。在SlWOX13的存在下，B3启动子明显被促进，与对照相比具有相对较高的LUC/REN比率。ACO1、ETR4、EIL1和ERF的表达。B3在slwox13突变体中被显著抑制，但在slwox13转基因果实中上调，表明slwox13-正调节这些基因的转录[图5A]。总之，这些结果表明，SlWOX13是一种转录激活剂，通过直接调节ACO1、ETR4、EIL1和ERF的表达，正向调节番茄果实中的乙烯生物合成、受体和信号传导。
图5。SlWOX13直接调节乙烯合成和信号传导相关基因。 （A） ACO1；（B） ETR4；（C） EIL1；（D） ERF。B3.（A-D中的i）电泳迁移率偏移测定显示SlWOX13与ACO1、ETR4、EIL1和ERF中存在的生物素标记的探针结合。B3启动子。符号+或–分别表示存在或不存在。（ii在A-D中）ChIP-qPCR测定显示SlWOX13与ACO1、ETR4、EIL1和ERF的启动子直接结合。B3.利用39 dpa条件下SlWOX13-4品系的果实进行分析。使用抗GFP抗体进行免疫沉淀，并使用IgG作为阴性对照。P1和P2表示通过ChIP-qPCR扩增的区域。（iii在A-D中）显示ACO1、ETR4、EIL1和ERF的反式激活的瞬时表达测定。 3.6 SlWOX13是番茄果实类胡萝卜素生物合成的关键调控因子 果皮变红是番茄果实成熟最明显的特征，伴随着叶绿素的降解和类胡萝卜素的积累。类胡萝卜素是番茄中最重要的营养成分之一，有助于番茄呈现红色。在这项研究中，类胡萝卜素的积累与SlWOX13的表达高度相关（图1C和2A），这意味着类胡萝卜素生物合成可能受到SlWOX13。 为了产生与类胡萝卜素积累相关的调控网络，我们检查了RNA-seq和ChIP-seq数据中鉴定的参与类胡萝卜素代谢途径的结构基因。一致地，SlWOX13能够在体外结合PSY1、PDS和BCH启动子[图6A（i）-6C（i）]和在体内[图6A（ii）-6 C（ii）]。此外，SlWOX13可以激活烟草叶片中PSY1、PDS和BCH的启动子[图6A（iii）-6C（iii）]。RT-qPCR分析证实，与野生型果实相比，slwox13突变体果实中PSY1、PDS和BCH的表达受到显著抑制，但在slwox13转基因果实中明显上调[图6A（iv）-6C（iv）]。总之，这些数据表明，在番茄果实成熟过程中，SlWOX13通过直接调节PSY1、PDS和BCH的转录，在类胡萝卜素积累中发挥重要作用。
图6。SlWOX13直接调控类胡萝卜素生物合成相关基因。 （A） PSY1；（B） PDS；（C） BCH。（i在A-C中）电泳迁移率偏移测定显示SlWOX13与存在于PSY1、PDS和BCH启动子中的生物素标记的探针结合。（ii在A-C中）显示SlWOX13与PSY1、PDS和BCH的启动子直接结合的ChIP-qPCR测定。（iii在A-C中）显示SlWOX13对PSY1、PDS和BCH的反式激活的瞬时表达测定。（iv在A-C中）39 dpa下WT、slwox13突变体和slwox13转基因果实中PSY1、PDS和BCH表达水平的RT-qPCR分析。 3.7 SlWOX13在果实成熟过程中直接激活成熟相关转录因子的表达 TFs在果实成熟的调控中起着至关重要的作用。在本研究中，许多SlWOX13调控的成熟相关基因不是SlWOX13。我们推测SlWOX13通过介导成熟相关转录因子的转录来调节这些成熟相关基因的表达。事实上，我们确定了几种调节番茄果实成熟的重要转录因子，如RIN、NOR和NAC4。 在番茄中，RIN和NOR已被确定为果实成熟的主要调节因子，通过转录调节参与番茄红素积累、乙烯产生、叶绿素降解和许多其他生理过程的基因。这些发现表明，SlWOX13与其下游成熟相关的转录因子一起，协调了一个分级转录级联，调节成熟相关基因的表达。 为了验证这一假设，我们进行了几个实验来验证SlWOX13直接调节RIN、NOR和NAC4的表达。EMSA和ChIP-qPCR分析显示，SlWOX13与这些催熟相关转录因子的启动子瞬时相互作用[图7A（i）-7C（i）和7A（ii）-7 C（ii）]。双荧光素酶测定表明，RIN、NOR和NAC4启动子的活性被SlWOX13显著诱导，分别具有约4.73倍、2.20倍和2.06倍的活化[图7A（iii）-7C（iii）]。RT-qPCR分析显示，RIN、NOR和NAC4的表达在SlWOX13转基因果实中显著上调，而RIN在SlWOX13突变果实中明显抑制，这与成熟表型一致[图7A（iv）-7C（iv）]
图7。SlWOX13直接调节关键的成熟相关转录因子。 （A） RIN；（B） NOR；（C） NAC4。（i在A-C中）电泳迁移率偏移测定显示SlWOX13与存在于RIN、NOR和NAC4启动子中的生物素标记的探针结合。（ii在A-C中）ChIP-qPCR测定显示SlWOX13与RIN、NOR和NAC4的启动子直接结合。（iii在A-C中）瞬时表达测定显示SlWOX13对RIN、NOR和NAC4的反式激活。（iv在A-C中）在39dpa下WT、slwox13突变体和slwox13转基因果实中RIN、NOR和NAC4表达水平的RT-qPCR分析。 04 结论  在成熟开始时，SlWOX13在果实中大量积累，并激活乙烯生物合成和信号传导相关基因以及类胡萝卜素生物合成相关基因的表达。此外，SlWOX13介导的乙烯合成对SlWOX13-基因表达具有反馈调节作用。此外，SlWOX13直接激活RIN、NOR、NAC4和DML2的表达，进而间接调节成熟相关基因的表达，从而加速果实成熟 05 原文获取 原文链接： https:///10.1093/plphys/kiad623 PDF获取： https://www./h-nd-285.html |
|
|
