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研究表明，间充质干细胞在再生医学中发挥作用在很大程度上是由其旁分泌主导而实现的，而不是其在损伤部位的增殖和分化。随着研究者们的深入研究，逐渐发现旁分泌机制的重要调控作用，而外泌体作为旁分泌机制中的重要活性物质被越来越多的实验证明在间充质干细胞修复损伤组织和组织再生方面起到关键作用。
外泌体的定义 细胞外囊泡(EVs)是内源性产生的膜结合囊泡，具有磷脂双分子层，其内包含各种分子，可根据细胞起源和生物发生而分为微囊泡、外泌体和凋亡小体。 过去，细胞外囊泡一直被认为是细胞废弃物，直到近些年才逐渐引起研究者们的兴趣。它们的来源、大小和内容物各有所区别，其中外泌体(Exosome)是一种存在于细胞外的多囊泡体，可通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多泡内涵体，内涵体与细胞膜融合后释放其中的小囊泡。此过程可将腔内囊泡释放到细胞外的环境中。 外泌体的提取方法 根据大量文献报道，外泌体的提取方法多样，可根据它的物理及生物特性分为以下几类提取方式，见下表。
超速离心法 超速离心法是一种根据外泌体的密度及尺寸进行分离的方法，其主要利用不同物质(如蛋白质、囊泡、细胞及细胞碎片等)在悬浮液中的沉降速度存在差异，通过逐渐增强离心力及离心时间来分离细胞、碎片和细胞器等，从而得到外泌体。 该方法包括一系列离心过程：首先300×g离心10min,2000×g离心10min去除死亡细胞，10000×g离心30min去除细胞碎片和大分子蛋白质，用0.22um滤膜过滤除去凋亡小体和微囊泡，然后100000×g离心2h得到外泌体，最后用PBS清洗沉淀以去除可溶的干扰蛋白质，并可于-80℃冻存。 在该方法中，外泌体的提取效率受离心力、样本黏度、PBS清洗次数等因素的影响。超速离心法是目前外泌体分离的“金标准”且为外泌体提取的最常用方法，其优势包括方法成熟、适用于大体积样本。然而，该方法的缺点在于仪器设备昂贵，操作耗时费力，所得的外泌体易受蛋白质聚合体和脂蛋白的干扰，外泌体易聚集成块。 密度梯度离心法 密度梯度离心法相比传统的超速离心法更为严格，能够根据样品密度进一步纯化，以清除由蛋白质等造成的干扰，使得到的外泌体纯度更高[22]。常用的分离介质包括碘克沙醇和蔗糖。 以蔗糖为例，实际操作时需要预先制备不同浓度梯度(2.0，1.3,1.16,0.8,0.5和0.25mol/L）的蔗糖/D20溶液,随后加入待分离物质；在100000×g条件下离心2.5h，外泌体将在等密度区域（1.13-1.19g/mL）驻留，收集该组分即可得纯化的外泌体。密度梯度离心法相较于传统差速离心法提取的外泌体更纯，但是操作较为繁琐。 超滤法 超滤法是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜离心分离外泌体。截留相对分子质量是指能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的相对分子质量。 外泌体是一个囊状小体，相对分子质量大于一般蛋白质，因此选择不同大小的截留相对分子质量超滤膜可使外泌体与其他大分子物质分离。该方法通常选用截留分子质量为100kD的超滤管，能够在提取外泌体的同时浓缩样本量。 这种操作简单、省时，可在低转速下提取到外泌体，不影响外泌体的生物活性，但滤膜吸附的囊泡和蛋白质不仅严重影响外泌体的提取效率，还可能堵塞滤孔，降低滤膜的寿命。 沉淀法 沉淀法是商业化外泌体提取试剂盒通常采用的策略，其中聚乙二醇是目前最常用的沉淀试剂。它具有极强的亲水性，可与疏水性的脂质双分子层结合，改变外泌体的溶解度或分散性使其沉淀。 该方法通过常规离心即可实现分离，若配合0.22 um滤膜可提高外泌体的纯度。基于沉淀原理的试剂盒均加入了聚乙二醇，其主要是先在低速离心条件下去除细胞碎片和蛋白质等，然后再加入试剂均匀混合，根据说明书要求静置一段时间后离心得到外泌体。 而不同品牌的外泌体提取试剂盒的用法和用量可能会存在差异，具体提取方法应根据说明书进行操作。有研究分别用TotalExosome Isolation试剂盒、Exo Quick试剂盒及差速超速离心法3种方法提取人脐带间充质干细胞来源外泌体并进行比较，发现超速离心法提取的外泌体中的蛋白浓度及纯度最高，Exo Quick试剂盒法其次，TotalExosome lsolation试剂盒法得到的蛋白浓度最低；但差速超速离心法和Total Exosome lsolation试剂盒法耗时长。 沉淀法操作简便、快速，外泌体回收率也较高，然而提取产物中混杂大量的蛋白质和RNA，纯度较差，而且其中的聚合物较难去除，对下游分析会产生一定不良影响。 免疫磁珠法 免疫磁珠是包被有单克隆抗体的球型磁性微粒，它可特异性地与靶物质结合。在超速离心的基础上，预先使磁珠包被含有外泌体相关抗原的抗体（如CD9、CD63、Alix），并与外泌体共同孵育，再用蒸馏水洗涤，重悬于PBS中。 这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、无需特殊及昂贵的仪器设备，但是对pH值和生理性盐浓度要求较高，否则会影响外泌体生物活性，不利于后续实验的开展。 随着对外泌体越来越深入的研究，人们发现它发挥的作用可涉及多个领域，如免疫调控、肿瘤相关治疗、肝脏炎症及中枢系统感染性疾病等。近年来，间充质干细胞来源外泌体已被鉴定为细胞间信息交流的潜在载体，外泌体相关的科学研究正在再生医学领域中大放光彩，关于外泌体的研究也有了突飞猛进的发展，外泌体在间充质干细胞修复损伤组织和组织再生中起到的关键作用而得到越来越多的重视。 |
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