  G-四链体（G4）结构是富含鸟嘌呤的核酸序列在一定条件下形成的一种特殊的二级结构，人类细胞中很多重要的位点都被证明具有形成G4的可能性，包括端粒DNA序列、启动子DNA序列等。已有大量文献报道，靶向端粒和启动子G4的小分子配体，通过抑制端粒功能和影响基因转录等发挥抗肿瘤效果，某些细胞核DNA G4配体也被证明具有激活免疫的效果，但对于线粒体DNA（mtDNA）G4配体的研究相对较少。同时，mtDNA G4结构的形成可能引发线粒体功能障碍、DNA损伤及ROS释放等多种效应，以上发生的一系列损伤事件都可能诱发mtDNA释放到细胞质中，并激活后续信号传导通路，最终产生抗肿瘤的作用。
近年来，深圳大学胡命豪课题组一直致力于靶向mtDNA G4小分子配体的研究（Sensor. Actuat. B-Chem., 2021, 330, 129391; Sensor. Actuat. B-Chem., 2022, 368, 132177; Eur. J. Med. Chem., 2024, 264, 116046）。近日，该团队设计并合成了一系列靶向mtDNA G4的三苯胺类小分子配体，并首次论证了此类化合物可以通过cGAS-STING通路激活免疫系统，并最终发挥抗三阴性乳腺癌（TNBC）生长及转移的效果，相关研究成果于近期发表于Eur. J. Med. Chem., 2024, 269, 116361。新型靶向线粒体DNA G-四链体的三苯胺类小分子配体的发现及免疫激活通路研究 本研究合成一系列三苯胺类靶向mtDNA G4的小分子配体（A1-A6）（图1），通过筛选体外结合mtDNA G4（mt6363）的能力及对于肿瘤细胞及正常细胞的毒性，得到效果最优的配体（A6）。通过荧光恢复实验及FRET实验等进一步证明A6结合及稳定mt6363的能力，并确定相关结合模式。细胞实验证明A6具有抑制小鼠4T1细胞生长及转移的效果，且RNA测序结果表明细胞质DNA传感途径是A6发挥药效的重要途径。
（图片来源：Eur. J. Med. Chem.）在4T1细胞中，A6可以诱发线粒体膜电位下降，mtDNA拷贝数降低及ROS释放等一系列线粒体损伤事件，另外通过线粒体中8-OG水平提升等证明A6具有损伤mtDNA的能力。通过confocal及qPCR实验证明A6有效诱导mtDNA被释放至细胞质（图2）。
图2 细胞模型中A6诱发线粒体损伤及mtDNA释放至细胞质（图片来源：Eur. J. Med. Chem.）cGAS-STING通路是最常见且相关机制报道最明确的细胞质DNA传感途径，作为固有免疫和获得性免疫的桥梁，在免疫调控及肿瘤治疗中发挥着至关重要的作用。cGAS作为一种重要的模式识别受体，可以直接感知细胞质的dsDNA，并开启下游免疫激活通路。Western blot实验结果证明A6激活cGAS-STING通路中的各种关键蛋白（cGAS、P-STING、P-TBK1、P-IRF3等），qPCR及ELISA实验结果证明A6诱发cGAS-STING通路下游基因（IFN-β、IL-6、TNF-α、ISG54、Viperin）的转录及表达。同时应用ROS抑制剂（NAC）及mtDNA复制抑制剂（ddC），证明A6诱发cGAS-STING通路激活与上游线粒体及mtDNA损伤密切相关（图3）。
（图片来源：Eur. J. Med. Chem.）在皮下接种4T1小鼠模型中，A6有效发挥抗肿瘤效果且整体毒性较低，流式实验结果证明A6调控肿瘤微环境中的多种免疫细胞水平及功能，包括促进巨噬细胞极化（M2型转变为M1型）、提高T细胞（CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD8+ IFNγ+ T细胞）数量及活性等，Western blot及ELISA实验证明A6在体内模型中同样激活cGAS-STING通路及下游事件（图4）。此外，在尾静脉接种4T1小鼠模型中，A6抗肿瘤转移的效果及机制也进行了相关讨论。
图4 动物模型中A6抗TNBC生长的效果及免疫激活机制（图片来源：Eur. J. Med. Chem.）综上，本研究成功设计并合成新型三苯胺类靶向mtDNA G4配体，筛选出最有潜力的化合物A6，证明其抗肿瘤生长及转移的效果，并探讨其相关信号传导通路。A6有效诱导4T1细胞线粒体及mtDNA损伤，mtDNA释放至细胞质并开启cGAS-STING通路，且在体外肿瘤微环境中调控抗原递呈细胞及T细胞的功能，并最终发挥抗肿瘤生长及转移的作用（图5）。本研究为首次证明靶向mtDNA G4的小分子配体具有激活cGAS-STING通路的能力，为后续G4小分子配体的研发提供新的思路。
（图片来源：Eur. J. Med. Chem.）该工作以“Discovery of a triphenylamine-based ligand that targets mitochondrial DNA G-quadruplexes and activates the cGAS-STING immunomodulatory pathway”为题发表在Eur. J. Med. Chem.上。DOI: 10.1016/j.ejmech.2024.116361。课题组老师王晓冬为论文第一作者，胡命豪为通讯作者。胡命豪课题组一直致力于以DNA、RNA核酸二级结构为靶点的药物化学生物学研究，重点研究新型小分子化合物在恶性肿瘤及感染性疾病治疗中的药效及作用机制。课题组近年来在Nucleic Acids Res.，J. Med. Chem.，Eur. J . Med. Chem.，SNB等领域权威期刊发表研究性论文30多篇。
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