  自闭症或自闭症谱系障碍（ASD）是一种神经发育障碍疾病，其核心症状是社交障碍和重复的刻板行为，发病率逐年递增，影响全球上亿人。近期人类遗传学研究确定钠离子通道SCN2A基因是ASD和智力障碍的最高风险基因，其表达水平对神经细胞正常功能的维持起着重要作用。神经元一直是ASD相关研究中的主要目标，但脑内神经免疫反应的改变也被认为与ASD的发生发展息息相关。小胶质细胞是大脑固有免疫细胞，参与神经炎症、突触修剪、髓鞘再生、神经发生与连接等多个过程，与多种神经系统疾病的发生和发展有关。因此，探究小胶质细胞在SCN2A基因缺陷的ASD疾病模型中的具体作用能够为治疗ASD提供新思路。   虽然ASD传统上被认为是一种多基因疾病，但大规模的人类遗传学研究已经发现了越来越多的ASD单基因病因。最近的研究发现SCN2A的功能丧失和蛋白质截短突变（统称为SCN2A缺乏症）是ASD的主要单基因因素。SCN2A基因编码的电压门控钠离子通道Ⅱ型（Nav1.2）在神经元中广泛表达，是神经细胞动作电位产生和传递的根源。研究表明神经-免疫相互作用可能在疾病进展中发挥作用。在正常大脑中，小胶质细胞是常驻的免疫细胞，通过突触修剪功能调节大脑发育和体内平衡。目前尚不清楚小胶质细胞介导的突触修剪在ASD相关疾病模型中的作用。  1、建立Scn2a严重缺陷小鼠模型，观察发育中期到成年阶段的突触功能和结构、小胶质细胞功能变化； 2、建立SCN2A-C959X缺陷类器官-小胶质细胞模型，进一步验证小胶质细胞增强SCN2A缺乏神经元中的突触吞噬。  1、scn2a缺陷小鼠的突触功能和结构受损 采用Morris水迷宫和Y-迷宫测试，结果显示与WT小鼠相比，SCN2A严重缺陷小鼠（HOM组）的长期学习和记忆能力、短期空间工作记忆能力明显受损。基于学习和记忆受损通常与海马区突触传递改变有关，因此，进一步研究Nav1.2缺陷是否影响海马CA1区主要锥体神经元的突触传递。通过记录在发育过程中的不同时间节点的微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）和树突棘的形态变化，结果发现与WT小鼠相比，Scn2a严重缺陷小鼠从发育中期开始出现明显的突触传递损伤，同时树突棘密度显著降低。 分离scn2a缺陷小鼠和WT小鼠的原代神经元进行培养，发现scn2a缺陷小鼠的神经元未成熟树突棘的比例在体外显著增加，而海马原代神经元树突棘密度无显著差异。这一结果可能表明，Nav1.2缺陷本身主要影响树突棘的成熟，而不影响海马锥体神经元的树突棘密度（图1）。  图1 成年Scn2a严重缺陷小鼠表现出学习和记忆受损以及突触功能和结构受损。 2、成年scn2a缺陷小鼠海马区小胶质细胞形态改变且溶酶体体积增加 小胶质细胞在调节神经元可塑性中发挥关键作用，并通过过度吞噬突触（突触前或突触后）参与神经元疾病的发病。以上体外实验发现WT和scn2a缺失神经元的树突棘密度没有显著差异，因此假设小胶质细胞可能是导致scn2a缺失小鼠树突棘密度降低的原因。接下来探究小胶质细胞的形态和相关基因表达。结果发现，与成年WT小鼠相比，scn2a缺陷小鼠海马CA1的小胶质细胞形态发生变化。此外，Iba1蛋白的表达没有显著差异，这表明小胶质细胞增殖的变化微乎其微。然而，与WT组相比，scn2a缺失组的小胶质溶酶体标志物（CD68）的体积显著增加，表明小胶质细胞可能被部分激活，发挥增强的吞噬作用。以上结果表明，小胶质细胞在scn2a缺陷小鼠中被部分激活（图2）。  图2 Scn2a严重缺陷小鼠海马区小胶质细胞表现出形态改变和溶酶体体积增加 3、小胶质细胞对突触的过度吞噬修剪发生在发育和成年期的scn2a缺陷小鼠中 为进一步研究小胶质细胞的激活是否转化为scn2a缺陷小鼠突触吞噬的增强，该研究用IBA1（小胶质细胞染色）和CD68（溶酶体染色）对成年小鼠海马CA1突触前（VGLUT1）)和突触后（PSD95）进行免疫组化。结果发现，在成年scn2a缺陷小鼠中，小胶质细胞对PSD95突触后的吞噬显著升高，但对VGLUT1突触前的吞噬没有可检测到的变化。这些数据表明，在成年scn2a缺陷小鼠中，海马小胶质细胞选择性地过度吞噬突触后，以调节神经元的可塑性。为了解这种吞噬在发育过程中何时开始，用IBA1和CD68对PSD95进行免疫组化，并在三个时间点（P5、P10和P30）进行检测。结果显示在发育过程中，小胶质细胞在小鼠出生后第30天开始大量吞噬树突棘，且小胶质细胞溶酶体体积也明显增大（图3）。  图3 在发育中期到成年，Scn2a严重缺陷小鼠海马区小胶质细胞过度吞噬修剪锥体神经元树突棘 4、补体C3参与scn2a缺陷小鼠中突触的小胶质细胞吞噬 研究报道经典的补体级联依赖性吞噬信号通路是小胶质细胞在发育过程中修剪突触的分子机制。因此，该研究假设在scn2a缺陷小鼠的发育过程中，经典补体级联通路可能被过度激活，导致大量未成熟树突棘被吞噬。为了研究C3和C1q是否靶向突触后，该研究对定位的PSD95和C3或C1q进行免疫组化，结果发现与WT小鼠相比，scn2a缺陷小鼠PSD95*/C3*和PSD95*/C1q*的点状蛋白水平在P30时显著升高，但在P5或P10时没有升高。C3/C1q与PSD95共定位的增加可能是由于C3/C1q位置的改变或C3/C1q沉积过度增加所致。为了验证这一点，进一步对WT和scn2a缺陷小鼠海马CA1 P30处的C3和C1q沉积进行免疫组化，结果发现与WT小鼠相比，scn2a缺陷小鼠的C3和C1q沉积均升高。以上数据表明，在发育早期，未成熟树突棘数量的增加可能导致补体通路过度激活，产生额外的C3和C1q沉积，促进小胶质细胞吞噬过多的未成熟树突棘（图4）。  图4 在发育过程中，Scn2a严重缺陷小鼠海马CA1区的补体C3和突触后蛋白PSD95发生大量标记 5、小胶质细胞消融可部分恢复scn2a缺陷小鼠海马CA1的突触传递和树突棘密度 接下来进一步研究早期小胶质细胞消融是否会恢复改变的突触功能。从P21开始，使用集落刺激因子受体1（CSF1R）抑制剂PLX3397配制的食物用于小胶质细胞消耗，小鼠连续喂养3-4周。对各组小鼠进行膜片钳mEPSCs记录和高尔基染色，结果发现，与对照组相比，PLX3397治疗的scn2a缺陷小鼠的神经元中mEPSCs的频率增加，并且其累积曲线发生了很大的变化。这一数据表明，小胶质细胞缺失可以部分恢复scn2a缺陷小鼠突触传递的改变。由于小胶质细胞通过改变树突棘密度参与突触重塑和可塑性，接下来研究对照组和plx3397处理的scn2a缺陷小鼠的树突棘密度。结果发现，与对照组相比，PLX3397喂养的scn2a缺失小鼠的树突棘密度也得到了部分恢。这些结果进一步证实了小胶质细胞在调节突触功能中起关键作用，小胶质细胞缺失可以部分恢复scn2a缺陷小鼠的突触传递和树突棘密度。  图5 在发育过程中，消融小胶质细胞能够恢复Scn2a严重缺陷小鼠海马锥体神经元的神经传递功能和树突棘密度 6、人源小胶质细胞在携带SCN2A-C959X突变的类器官中突触修剪增强 自闭症相关的SCN2A功能丧失和蛋白质截短突变导致SCN2A缺陷，Scn2a缺陷小鼠模型仅部分模拟该疾病。为了将研究从啮齿动物模型扩展到人类细胞，该研究建立了一种携带SCN2A蛋白截断短停止密码子C959X杂合突变的人诱导多能干细胞（hiPSCs）模型，且SCN2A中的C959X突变能够导致Nav1.2通道无功能（SCN2A缺陷）。这些经过工程改造的人类多能干细胞随后被分化为大脑皮层类器官，有望部分重现人类大脑的复杂性。对照hipscs衍生的小胶质细胞将被添加到皮质类器官（C959X或对照组皮质类器官）中培养两周，发现人源小胶质细胞可以在C959X类器官内均匀生长、融合和均匀分布，并控制皮质类器官。接下来对IBA1和CD68、PSD95进行免疫组化三染，并重建了两种类器官的3D图像进行量化，结果发现C959X突变组大脑类器官中，人源小胶质细胞大量吞噬神经元突触后蛋白PSD95，并且人源小胶质细胞体积也明显变大，进一步支持小胶质细胞增强SCN2A缺乏症神经元的突触吞噬（图6）。 图6 在携带有自闭症相关SCN2A-C959X突变的皮质类器官中由人类多功能干细胞衍生的小胶质细胞突触修剪显著升高 该研究揭示了小胶质细胞在与ASD相关的SCN2A缺陷疾病模型中的作用。研究发现，Scn2a在小胶质细胞中的表达极低，但小胶质细胞介导的过度吞噬修剪突触在自闭症相关的Scn2a缺陷小鼠模型的疾病发病机制中发挥了重要作用。此外，在SCN2A严重缺陷的啮齿动物和人类细胞模型中小胶质细胞修剪病变神经元过多突触的能力是进化保守的。该研究强调了从整体角度研究ASD等神经发育/精神疾病的重要性，揭示了神经-免疫相互作用在疾病中的必要性。 参考文献 Wu J, Zhang J, Chen X, Wettschurack K, Que Z, Deming BA, Olivero-Acosta MI, Cui N, Eaton M, Zhao Y, Li SM, Suzuki M, Chen I, Xiao T, Halurkar MS, Mandal P, Yuan C, Xu R, Koss WA, Du D, Chen F, Wu LJ, Yang Y. Microglial over-pruning of synapses during development in autism-associated SCN2A-deficient mice and human cerebral organoids. Mol Psychiatry. 2024 Mar 18. doi: 10.1038/s41380-024-02518-4. Epub ahead of print. PMID: 38499656. |
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