【原】特别关注｜胆汁淤积性肝病动物模型构建的研究进展

临床肝胆病杂志 2024-06-19 发布于吉林

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胆汁淤积性肝病(CLD)是一类由免疫、遗传、环境等因素导致胆汁形成、分泌和排泄障碍的肝胆疾病总称。一项基于上海市慢性肝病的多中心流行病学研究表明，在4 660例慢性肝病患者中，胆汁淤积的患病率为10.26%。CLD起病隐匿，临床早期无明显症状，进展期可出现黄疸、尿色加深、皮肤瘙痒等一系列高胆红素血症相关表现，可进一步发展为肝纤维化、肝硬化，甚至出现肝衰竭等终末事件。CLD根据发生部位可分为肝内胆汁淤积和肝外胆汁淤积，包括胆道闭锁(BA)、胆石性肝病、药物性胆汁淤积性肝病(DIC)、妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)、IgG4性自身免疫性肝病、原发性胆汁性胆管炎(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)。

CLD发病机制复杂，诊断困难，治疗亟需解决。为了加深对CLD本身的认识，同时帮助临床医师在探究CLD机制和寻找新疗法的研究中更科学、合理地选择工具，本文就CLD的动物模型的制备、机制、优缺点作一综述。

1BA动物模型

BA是一种发生于婴儿时期的肝脏内胆管异常狭窄、阻塞或者完全缺失的疾病，可导致胆汁淤积、胆道反复炎症、胆管纤维化。新生儿胆汁淤积症患病率为1/2 500，约34%~43%为BA。本病病因尚未明确，如不及时诊治，可迅速进展至肝硬化、肝衰竭等终末期肝病而致死亡。因此，对该病病因及发病机制的深入研究对于预防疾病尤为关键，而BA模型的构建是为其提供重要条件。

(1) 胆总管结扎BA模型: 2008年，国内学者张守华等通过结扎5~6周龄BALB/c小鼠胆总管建立梗阻性黄疸模型，炎症细胞变化与BA实际情况相符，术后剖腹可见近端胆总管囊性扩张，胆囊增大，肝脏呈淤胆性改变，但该模型存在以下缺陷：①成年小鼠的胆道系统已经发育成熟，与发生于婴儿期的BA年龄不匹配；②临床症状方面未很好地复现出BA的腹水等门静脉高压的并发症；③病理组织学方面可见肝小叶结构模糊，胆汁淤积及大量增生的胆管，以及片状坏死的肝细胞，但未见到肝内外胆管消失、肝纤维化甚至假小叶形成。而后国内学者葛军涛等对该模型进行改良，通过结扎新生BALB/c小鼠(出生后5~7天)的胆总管建立BA模型，术后2天出现黄疸、小便深黄、陶土样大便、食欲不振、精神状态差等症状，这与临床上BA临床症状有较为相似，术后10天左右出现实验组小鼠死亡高峰期。该模型的优点在于造模方法相对简单，重复性好，周期短，但也存在一些缺点：死亡小鼠解剖后可见增宽的胆总管、大胆囊，黄染的肠道及肾脏，但未见严重的肝硬化、门静脉高压、肝衰竭等情况，这与临床上患儿终末期表现不相符，其次该动物模型制备在小鼠出生后5~7天进行，无法完全模拟围生期胆管闭锁情况。

(2) 毒素诱导BA模型：最初探索来源于1990年澳大利亚学者Harper和Kopp观察到孕期进食了藻类等植物的牛羊，产下的幼崽在出生后大量死亡，临床表现符合胆汁淤积症状，病理组织学表现为慢性肝损伤、肝纤维化、肝细胞坏死及肝硬化等情况，但限于当时医学的局限性，未进行动物模型的探索。2015年，国外学者发现一种新型胆管损伤化合物“异黄酮、胆甾烯”，该化合物可造成斑马鱼幼虫的肝外胆道系统的选择性破坏。该团队还发现斑马鱼基因组某个特定区域突变可增强该化合物的胆道毒性，可导致培养的新生小鼠肝外胆管细胞纤毛丢失，并破坏胆管细胞细胞极性和细胞膜的完整性。同时该团队证实该区域与人类BA易感性位点具有高度同源性。这研究进一步证实了环境毒物在BA发生发展中的作用。2019年我国国内学者杨一凡等建立胆闭素诱导斑马鱼BA模型，通过胆道排泄功能证实胆道毒性，并将造模成功的斑马鱼转移至不含胆闭素的培养水中，发现其无法生存超过12天，这提示胆闭素诱导的胆道畸形是不可逆的，以上在一定程度上揭示环境毒素与BA发生的潜在关系，为BA的预防和辅助治疗提供一定的思路，但目前基于哺乳动物的毒物诱导BA模型尚未报道，对于以上毒物对于胆管系统发育的具体影响尚未揭露，希望能进一步建立起与人类BA相近的动物模型。

(3) 病毒诱导BA模型：目前有统一观点认为各种宫内或围产期感染是BA主要的病因，病毒感染触发免疫反应，导致胆道进行性破坏。基于以上观点，学者建立了第一个小鼠模型，将恒河猴轮状病毒接种到刚出生的小鼠身上，使肝外胆管出现类似BA的表现。但不幸的是，这个模型有几个实际的限制影响实验的可重复性，包括病毒作用的时间和剂量，注射相关的腹部器官的损伤，以及菌株间的差异和模型的低存活率。

2胆石性肝病动物模型

胆石症是胆道系统的一种常见病，成年人患病率为11%左右。当胆汁的化学成分不平衡，胆固醇在胆汁中呈现过饱和状态进而沉淀析出，则会形成胆结石。其次在一些溶血性疾病中，红细胞破坏程度异常高，导致胆红素过量，进而形成胆石。此外，胆囊运动能力低下或收缩能力受损会影响胆囊内胆汁的有效清除，导致胆汁高度浓缩，最后发展为胆石症。早期Tepperman等通过给小鼠喂食含有胆固醇-叶酸的饮食制备胆石症模型，这种饮食包含高脂肪、高胆固醇和0.5%的胆酸。该研究表明胆酸与胆固醇的结合对于胆结石的形成是必不可少的，而单独的胆固醇不能诱发胆结石。而后，多位学者对不同种系的小鼠进行造模研究，揭示了Lith1和Lith2基因是胆结石易感性增加的主要原因。Wilund等利用C57L/J小鼠饲以成石饮食研究耐力运动的抗结石效果，为耐力运动训练可预防胆结石的观点提供了证据。

3DIC动物模型

DIC是以胆管细胞损伤为特征，临床表现为黄疸、瘙痒、碱性磷酸酶升高的疾病。最近一项国内多中心流行病学调查表明，在住院的药物性肝损伤患者中，胆汁淤积型约占20.31%。

目前关于该病的发病机制及治疗仍存在争议，而动物模型的研究与开发是解决该问题的关键步骤。胆汁酸盐输出泵(BSEP)是负责转运胆汁酸盐，定位于肝细胞胆小管侧膜的一类ATP结合盒超家族蛋白。BSEP的抑制早先被认为是一个关键的分子启动事件。药物可通过抑制转运蛋白活性、减少蛋白表达、改变其亚细胞定位、促进其突变，影响胆汁酸的转运功能，从而影响胆汁酸的平衡。基于以上基础，有学者提出BSEP(Abcb11)^-/-小鼠模型有助于阐述Bsep扰乱的连续影响，同时确定可能的胆汁酸运输系统替代方式。该模型的一个缺点是出现轻度非进行性胆汁淤积，可能是由于小鼠的内源性胆汁酸与人类相比具有更强的亲水性。Wang等提出可以通过给BSEP^-/-小鼠注射额外的胆汁酸来解决以上的问题。

一些常见的肝损伤药物也用于DIC模型的制备。氯丙嗪是世界卫生组织治疗精神类疾病的基本药物，但该药物含有许多不良反应，其中包括胆汁淤积。目前氯丙嗪被认为是通过直接抑制BSEP来诱发胆汁淤积，同时抑制BSEP和MDR3(肝细胞基底侧转运蛋白)基因的表达，因该研究基于人的HepaRG细胞系，缺乏免疫细胞和其他的肝细胞的环境，且该细胞系来源于单一的男性捐赠者，同时细胞系的胆汁酸转运体及胆汁酸合成能力有限，使这个模型有一定的局限。国内学者使用氯丙嗪大鼠腹腔内注射造模，大鼠血生化指标符合DIC变化，电镜下见扩张的毛细胆管及淤胆样改变，内质网扩张甚至崩解，线粒体肿大，小叶内及汇管区炎性细胞浸润。该模型的缺陷在于：造模组存在死亡情况，药物注射剂量需进一步调整。环孢素A用于防止器官移植后的移植物排斥反应。在环孢素A治疗期间观察到的最严重的副作用是肾脏毒性和肝脏毒性，肝脏毒性多表现为胆汁淤积并伴有低至中度高胆红素血症。与氯丙嗪类似，环孢素A处理的啮齿动物也被广泛用作DIC的实验模型，考虑该药物影响膜上的转运蛋白及膜的流动性，但关于不同亲水性胆汁酸是否对以上因素有影响无进一步研究。

4ICP动物模型

ICP是一种CLD，指是在怀孕的最后3个月，零星出现复发性黄疸、瘙痒、胆汁酸水平升高和/或ALT/AST升高，可导致胎儿不良结局，如早产、呼吸窘迫综合征或死胎。ICP发生的危险因素可能与遗传、环境和激素等有关，但具体发生机制尚不清楚。目前研究最多的是ABCB4基因编码MDR3蛋白，分布于肝细胞的毛细胆管面，在正常胆汁形成中存在重要作用，在ICP中，MDR3的突变达15%。

此外，有研究表明雌激素在ICP的发生发展中起重要作用。ICP多发生在妊娠的最后3个月，此时雌激素水平达到最大值，其次与单胎妊娠相比，雌激素水平增加的双胎和三胎妊娠ICP发生率更高。有ICP家族史或个人史的妇女在接受高剂量雌激素口服避孕药治疗时，更容易出现ICP。已经确定的环境因素包括与血浆中硒含量增加有关的ICP发病率的增加，这在不同的季节里是不同的。有研究发现雌性激素，如雌二醇-17β-D-葡萄糖醛酸，是动物体内可逆性胆汁淤积的诱导剂。给啮齿动物注射合成的炔雌醇或雌二醇-17βD-葡萄糖醛酸酯可用于研究ICP的基本机制。

5PBC动物模型

PBC是一种针对肝内中小胆管的自身免疫反应引起的缓慢进展的CLD。该疾病的特点是免疫介导的肝内胆管的破坏和门静脉炎症。肝组织学特征包括早期的门静脉炎症，胆管周围肉芽肿形成，肝门静脉区嗜酸性粒细胞浸润，选择性中小胆管破坏，进而可发展为肝纤维化，甚至肝硬化。PBC临床表现多样，可表现为瘙痒、乏力、黄疸、干燥综合征、腹部不适、骨质疏松等，而典型表现为胆汁淤积的血清学表现和抗线粒体抗体(AMA)阳性。

第一个创建的模拟PBC的模型包括带有淋巴增生性(lpr)基因的MLL/lpr小鼠。该基因导致严重的自身免疫性疾病，包括淋巴结病、高丙种球蛋白血症、肾小球肾炎、关节炎和干燥综合征等，且存在一定程度的AMA阳性，同时，MLL/lpr小鼠呈现出类似PBC的组织学特征如非化脓性破坏性胆管炎、胆管受损甚至缺失等。在这个模型中，研究者在肝脏中观察到较高水平的MHC Ⅱ类表达，且门静脉中CD4⁺ T淋巴细胞占主导位置，考虑以上因素促进自身免疫疾病的发展。该模型存在以下缺陷：(1)AMA阳性率不高，大约为50%；(2)MLL/lpr小鼠会出现与人类PBC临床特征不相符的情况，包括血清胆红素、肝酶存在明显差异；(3)MLL/lpr小鼠并没有存活到肝硬化阶段，早期大部分因相关的肾病已死亡。在此基础上，Zhang等学者对动物模型进行改进，创建了基于调节性T淋巴细胞(Treg)缺陷的Scurfy小鼠。Foxp3基因对Treg细胞的发育、维持和功能至关重要，而Scurfy小鼠存在该基因突变，导致Foxp3⁺ Treg细胞完全消失，进而全身免疫性疾病(如PBC)的易感性增加。该模型表现出与人类相符的血清学、免疫学和组织病理学特征，但其局限性在于免疫耐受破坏严重，寿命短，不利于对PBC发病过程及进展机制的研究。另外，在白细胞介素2受体α(IL-2Rα)缺乏的基因敲除小鼠中，也取得了类似的疾病表型。IL-2Rα^-/-小鼠表现出门静脉淋巴细胞浸润和细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2的数量增加，与PBC早期变化相近，该模型有利于研究其早期发病机制。该模型的缺陷在于没有形成肉芽肿，并未发展成慢性胆汁淤积。此后又有学者开发了新的模型，通过引入Cl-/HCO3^-阴离子交换蛋白2(AE2)基因失效的突变，来减少Treg细胞的数量。AE2参与胃质子分泌和分泌素刺激的胆道HCO3^-的释放，其紊乱对胆汁酸、胃酸平衡有影响。成熟的Ae2(a, b)^-/-小鼠显示出与PBC相似的免疫和肝胆变化，但同样也有与PBC不同的改变，包括胃酸分泌受损和AMA偏低。非肥胖糖尿病(NODc3c4)小鼠可发展出一种类似于PBC的自身免疫性胆道疾病，具有相似的免疫学和血清学特征。然而，NODc3c4小鼠也表现出一些PBC的非特异性特征，包括胆道扩张和囊性病变，没有出现慢性损伤性胆管炎。ARE-Del^-/-小鼠的表型与人类PBC非常相似，尤其是在组织病理学、免疫学和血清学层面。与其他模型不同，这种小鼠模型是能体现出女性占优势的情况，有益于阐明女性对PBC的易感性增加背后的关键机制。

6PSC动物模型

PSC是一种长期的慢性肝病，以肝内和/或肝外胆管的炎症和纤维化为特征，导致多灶性胆管狭窄、慢性胆汁淤积，严重可进展为终末期肝病。临床上可表现为右上腹痛、瘙痒、疲劳、黄疸、肝肿大和脾肿大。10%~20%的PSC患者会自发地发展成胆管癌。Mdr2^-/-小鼠是最早用于研究PSC的动物模型。Mdr2基因是人类MDR3(ABCB4)基因的同源物，编码一种转运器，可将磷脂通过管状膜分泌到胆汁中。Mdr2基因突变可导致胆管上皮细胞损伤、胆管纤维化、硬化性胆管炎，与人类PSC组织学病变相似。Mdr2^-/-小鼠模型的主要缺点是无法创建合并IBD模型和无法模拟人类PSC肝细胞癌的自发发展。第二个模型是基于肝脏囊性纤维化跨膜转运调节体(CFTR)的功能障碍会引发肝内胆管阻塞、胆汁淤积、胆管增生、肝纤维化的原理而创建的。研究表明，Cftr^-/-小鼠可发展为渐进性肝病，伴有局灶性胆管炎、漏出的胆汁和胆管增生。但Cftr^-/-小鼠只表现出肠道表型，其他器官的病变轻微或不存在，这与以上研究结果不相符。此外，Cftr^-/-小鼠的这种肠道表型更类似于远端肠梗阻综合征和胎粪回流，而不是PSC的典型IBD表型。因此，该模型很少被作为PSC的实验模型。

红细胞生成性原卟啉症是一种遗传性血红蛋白合成疾病，该疾病带来的铁螯合酶活性降低容易导致胆管上皮损伤而导致胆道纤维化，出现严重的肝脏疾病。铁螯合酶缺陷(fch/fch)小鼠表现为明显的胆汁淤积表型，血清肝酶增加，胆汁酸盐和原卟啉增加，在3个月内发生严重的肝纤维化并发展为肝硬化。

α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)是一种用于制备阳离子芳香族聚氨酯的化学品，它能充分诱导大鼠和小鼠的胆汁淤积，导致胆管上皮细胞损伤，进而导致肝细胞坏死。长期接触ANIT会导致出现慢性胆管炎、胆管增生和胆管周围纤维化的情况，以此出现了慢性ANIT模型。3, 5-二乙氧基羰基-1, 4-二氢吡啶(DDC)是一种致卟啉剂和δ-氨基酮酸合成酶的强启动剂，会诱发小胆管的阻塞，从而引发胆汁淤积。DDC诱导的胆汁淤积症以硬化性胆管炎和明显的胆汁纤维化为特征，且伴有导管增生，该动物模型制备简易，较好地模拟PSC相关情况，对进一步探索PSC发病机制起关键作用。因此，喂养啮齿动物的DDC可用于研究(异物引起的)慢性胆管病。石胆酸是一种有毒的内源性胆汁酸，当存在异常高的浓度时也会诱发胆汁淤积。据此，石胆酸啮齿动物模型可用于研究这种内源性胆汁酸的作用，以及了解胆汁酸在胆汁淤积症发病机制中的潜在作用。

7结语

综上所述，胆汁淤积是多种疾病过程中常见的病理改变，发病机制复杂，至今尚未完全阐明。基于此的模型是研究者探索其发病机制、研究治疗方法的方向。目前动物模型存在一些问题：(1)种内差异。主要集中在造模菌种、动物模型性别以及年龄的差异。同样的菌种在不同品系的动物中出现不同的表型，不同的动物性别以及年龄对于模型制备的敏感性不同。(2)种间差异。包括不同种间胆汁酸成分亲水性不同，胆汁酸转运体的底物特异性不同，代谢解毒存在差异等。(3)除了种内种间差异之外，以上不同的动物模型各有其特有的缺点。因此，应充分认识每个模型的具体局限性，根据不同的研究目的来选择适当的动物模型，并通过结合多种体内啮齿动物模型来设计新的模型，从而规避局限性，努力建立一个低成本、方便操作、易于重复、病理改变与人类疾病相符的理想动物模型。