中性粒细胞和巨噬细胞通过TRIF/CD14驱动TNF诱导的细胞死亡

TNF介导多种生物过程，对TNF介导的炎症和细胞死亡反应已经在TNFR1的下游进行了广泛研究，现在认为两者分别依赖于下游促炎症复合物I和促死亡复合物II的形成。在这里，作者新发现TLR4下游配体TRIF介导形成促死亡复合物，在TNF诱导的小鼠败血症中发挥重要作用。TRIFosome在TNF-R1通过CD14内化的下游增强了TNF介导的细胞死亡和炎症细胞因子的释放。具体来说，在TNF驱动的败血症小鼠模型中，中性粒细胞导致了TRIF介导的细胞因子释放，而巨噬细胞导致了TRIF诱导的细胞死亡。因此，TRIFosome对TNF介导的败血症的炎症和细胞死亡反应至关重要。

▉结果：

1。TRIF介导TNF诱导的炎症和巨噬细胞死亡

Y.p.细菌感染能够诱发巨噬细胞自分泌TNF通过Trif激活caspase-8介导的细胞死亡。基于此，作者比较了Tlr4、Tnfr1和Trif KO的巨噬细胞经Y.p.菌诱导死亡的能力发现Tlr4和TNF-R1KO两者敲除提供的保护能力相当，但是Trif KO细胞明显能够更好的抵抗Y.p.诱导的死亡（Fig1A）。通过IP分析发现Trif KO细胞能够抑制死亡复合物的形成，其中骨髓来源的巨噬细胞中RIPK1和FADO关联盐城，相反，在没有TNF-R1的情况下，复合物的形成似乎在后期减弱，支持自分泌TNF维持和扩大由TRIF引发的Y.p.诱导的细胞死亡的模型（图1B）。因此，与B6和Tnfr1-/-细胞相比，Trif-/-细胞中caspase-8到p18亚基过程也延迟了。

那么TRIF是否直接参与TNF-R1介导的细胞死亡，在5Z-7-oxozeaenol（5z7；图1C）的存在下用TNF激活BMDMs，模拟由Y.p.感染驱动的细胞死亡，依赖于caspase-8、RIPK1激酶活性和pyroptosis effector gasdermin-D（GSDMD）。为了简化数据的解释，用特异性激活TNF-R1的重组人TNF（hTNF），消除了可能来自TNF-R2的贡献，后者可能通过不同的机制诱导细胞死亡。除了对TNF-R1和TNF的依赖，hTNF/5z7诱导的细胞死亡也明显依赖于TRIF、TRIF相关的适应分子（TRAM）和LPS共同受体CD14（图1C）。相反，不依赖TLR3和TLR4（图1C），这些数据证明了Trif在TNF驱动的细胞死亡中的独特作用。并且这种作用不是由于TNF的内毒素污染所导致的（图1，C和D）。

为了确定TRIF和CD14是否对TNF诱导的其它细胞死亡方式是否发挥作用，用hTNF在环己胺（CHX）或SMAC模拟物（SMAC）和泛肝素酶抑制剂zVAD的存在下处理BMDMs，分别驱动细胞凋亡或坏死。缺少TRIF和/或CD14，而不是TLR3和/或TLR4，提供了对TNF诱导的细胞凋亡和坏死的保护，表明这些蛋白的作用超出了由hTNF/5z7诱导的caspase-8介导的pyroptosis。

Tnf和Ifnb基因的转录激活在Trif-/-和Cd14-/-中被抑制，但在Tlr3-/-Tlr4-/-BMDMs中没有明显影响（图1D）。在Tram-/-、Trif-/-和Cd14-/-而不是Tlr4-/-巨噬细胞中，用TNF或TNF/5z7激活的MAPKs如p38和细胞外信号调节激酶（ERK）的激活有缺陷，这从机制上解释了这种炎症特征的缺陷（图1E和图1F）。由于5z7抑制上游的MAPK TAK1，对TNF/5z7的反应中，炎症表型被严重抑制。然而，TRAM、TRIF和CD14的缺乏进一步削弱了p38和ERK的激活。表明NF-κB激活的IκBα降解在Trif-/和Tram-/巨噬细胞中没有，在Cd14-/BMDMs中也没有显著差异（图1E）。这些结果强调了TRIF和TRAM在激活TNF下游的MAPK和NF-κB途径中的关键作用，并确定了CD14在这个过程中的额外的非冗余作用。

为了进一步确定TNF以TRIF依赖性方式激活的信号通路，免疫沉淀TNF激活的巨噬细胞中的RIPK1，并探测了参与TRIF介导的对LPS的信号传导的促炎症复合体成分（图1F）。检测到TNF受体相关因子3（TRAF3）、TANK结合激酶1（TBK1）和NEMO在对TNF的反应中与RIPK1结合，这在TRIF缺失的情况下被削弱，这表明TRIF在对TNF的反应中调节促炎症复合物的形成方面起着关键作用（图1F）。TNF介导的TRIF适配蛋白TRAM与RIPK1的结合进一步证实了这一点。因为TRAF不定位在质膜上，而只能被定位在内体区的受体所接触，这些结果表明，TNF诱导的TRIF依赖性促炎症复合物发生在内体。这一发现特别有趣，因为TRAF3的参与可能解释了I型干扰素（IFN）如何以TRIF依赖的方式在TNF-R1的下游被诱导。

尽管在没有TRIF的情况下，促炎症成分与RIPK1的结合基本上被抑制，但在TNF激活的细胞中，TBK1和NEMO的弱结合仍然存在（图1F）。因为TBK1和NEMO已知在TNF-R1介导的复合物I中发挥作用，这表明RIPK1在对TNF的反应中参与TRIF依赖的和TRIF不依赖的促炎症复合物。为了分离TRIF依赖的复合物，在TNF刺激的BMDMs中用TRAM作为TRIF的代理进行TRAM特异性IP。与RIPK1特异性IP类似，我们观察到RIPK1、TRAF3、TBK1和NEMO在TNF反应中的结合，这在没有TRIF的情况下完全被废除（图1F）。这些结果表明，TRIF/TRAM在对TNF反应形成含RIPK1的促炎症复合物中起关键作用，该复合物与TNF-R1介导的复合物I不同。作者把这种复合物称为 "促炎症TRIFosome"。

为了证实TNF激活的信号通路依赖TRIF，用TNF/5z7诱导细胞死亡，免疫沉淀FADD，并检测RIPK1和caspase-8，分析促死复合物的形成。在没有TRIF或CD14的情况下，复合物的形成减弱图1G）。如同在促炎性TRIFosome（图1F）中，TRAM在TNF/5z7处理后被招募到促死复合物中，支持复合物成分和TRIF之间的相互作用（图1G），并为在没有TRAM的情况下观察到的对TNF/5z7诱导的细胞死亡的抵抗（图1C）。为了分离TRIF依赖的促死复合物，我们在TNF/5z7刺激的巨噬细胞中进行了TRAM特异性IP（图1G）。观察到FADD、RIPK1和caspase-8与TRAM的结合，这在Trif-/-和Cd14-/-巨噬细胞中是不存在的。TRIF的缺乏延迟和减弱了凋亡性caspase-3和caspase-7的裂解，以及caspase-8裂解下游的pyroptotic效应物caspase-1和GSDMD（图1H）。表明TRIF的缺乏并没有改变TNF/5z7诱导的细胞死亡模式，而是延迟和抑制了这种反应。为了支持这一点，TNF/5z7诱导的细胞死亡在Trif-/-BMDMs中依赖于caspase-8和RIPK1，部分依赖于caspase-3和caspase-7，与B6相似（图1I）。正如我们以前在LPS/5z7诱导的死亡中看到的那样，TNF/5z7诱导的Trif-/-细胞死亡完全依赖于RIPK1的激酶活性，因为用Necrostatin-1（Nec-1；图1I）处理提供了保护。这些发现支持一个模型，即在没有TAK1活性的情况下，TRIF介导的TNF-R1下游的激活导致形成一个TRIF依赖的促死复合物（prodeath TRIFosome），包含FADD、RIPK1和caspase-8，它通过增强GSDMD和执行者caspase的激活扩大细胞死亡（图1, G和H）。迄今为止，TRIF被描述为仅在TLR3/4的下游发挥作用；然而，这些数据指出了TLR途径组件在活化的TNF-R1下游的作用。

2.巨噬细胞中，CD14介导的TNFR1内化作用促进TRIF-RIPK1共定位

在LPS诱导下，CD14介导TLR4的内吞作用，促进TRIF的激活。CD14可能类似地调节TRIF在TNF反应中的激活。TNF模拟导致CD14在1小时内内化，并导致TNF-R1与RAS相关蛋白RAB5A+内体早在处理后10分钟就有了共定位。TNF-R1的内体定位至少部分依赖于CD14，但独立于TRAM发生，表明CD14在TNF-R1的内化中具有特殊作用，并表明CD14在TLR和TNF超家族中其他免疫受体的内化和激活中具有未被发现的潜在作用。虽然TRIF很难用Western blot检测，但在TNF激活的巨噬细胞中可以检测到TRIF特异性的点状物。这些点状物与RAB5A+内质体聚集在一起，但只在暴露于TNF后10至30分钟才可检测到。在没有CD14或TRAM的情况下，TRIF特异性点状物不能形成。这些结果表明，CD14是TRIF内体定位和低聚物的必要条件。鉴于TRAM在应对LPS时能够定位到富含CD14的质膜区域，但与TLR4无关，因此在应对TNF时，CD14在内体中的富集可能足以使TRAM/TRIF内体定位和激活。

鉴于RIPK1在应对TNF的TRIF依赖性死亡和炎症信号中起着不可或缺的作用，并且我们检测到RIPK1在应对小鼠TNF（mTNF）或mTNF/5z7时与TRIF贩运适配器TRAM结合（图1，F和G），我们测试了TRIF-RIPK1的相互作用是否可以通过免疫荧光进行可视化。因此，使用抗TRIF抗体来寻找TNF或TNF/5z7刺激的巨噬细胞中RIPK1与TRIF的共定位（图2，A至E）。在对mTNF和mTNF/5z7的反应中，刺激后10至30分钟观察到TRIF点（图2，A至C）。然而，与TNF/5z7相比，单独对TNF的反应中，点状物较大，但数量较少，从而表明细胞对促炎症信号的极化维持了TRIF-RIPK1的相互作用和复合物的形成（图2，A至C）。用mTNF或mTNF/5z7刺激20分钟后，TRIF和RIPK1高度共聚焦（图2，A、D和E）。然而，在没有CD14的情况下，TRIF和RIPK1特异性点的形成和共定位被取消，这表明CD14在TRIF寡聚和招募到RIPK1的上游发挥作用（图2，A至E）。此外，TNF-R1缺陷的细胞促进了TRIF的聚集及其与RIPK1的协同作用，尽管这种作用弱得多（图2，A至E）。

3.TRIF和CD14介导体内TNF诱导的死亡

为了明确TRIF介导的TNF反应在生理上的作用，我们认为caspase-8和GSDMD在LPS和TNF致死的小鼠模型中都起着关键作用，这表明体内对TNF的反应也可能是由TRIF调节的。为此，我们用mTNF[9μg，静脉注射]挑战野生型B6、Trif-/-、Cd14-/-和其他几种有相关基因缺陷的小鼠，并每小时监测体温（图3A）。尽管B6小鼠在4至8小时TNF诱导的死亡，但Trif-/-和Cd14-/-小鼠对TNF诱导的低温有抵抗力，约70%的动物在注射TNF后至少存活24小时（图3B）。与Tnfr1-/-小鼠类似，100%的Cd14-/-Trif-/-双基因敲除小鼠对TNF致死有保护作用（图3，A和B）。然而，TNF的缺乏只提供了一个轻微的死亡延迟（图3，A和B）。注射TNF会诱发肠道上皮细胞的死亡，破坏上皮屏障，使肠道微生物群渗漏。因此，微生物从肠道漏出和内源性损伤信号的释放可能是驱动我们对TNF反应的TRIF依赖性表型的原因。然而，与B6相比，Tlr3-/-、Tlr4-/-和Tlr3-/-Tlr4-/-双基因敲除小鼠对TNF诱导的低体温有类似的敏感性（图3，A和B），从而否定了TRIF驱动TLR3/4下游的TNF诱导反应的可能性，并暗示了以前未探索的内体适配器TRIF的激活模式。在对表型的进一步机理研究中，Trif-/-、Cd14-/-和Cd14-/-Trif-/-，而不是Tlr3-/-、Tlr4-/-或Tlr3-/-Tlr4-/-，小鼠在注射TNF 4小时后血清中TNF、IFN-β和白细胞介素-1β的积累减弱了（图3C至E），表明TRIF和CD14，类似于TNF-R1，对体内TNF的促炎症反应至关重要。Trif-/-和Cd14-/-小鼠血清中释放的IL-1β水平较低，这是炎症细胞死亡的结果，意味着TRIF和CD14也可能调节对TNF反应的细胞死亡。在没有TRIF和CD14的情况下，血清乳酸脱氢酶（LDH）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平下降，分别表明细胞死亡和肝脏损伤（图3, F和G）。

绒毛变钝和肠道上皮细胞死亡是小鼠TNF毒性的标志。观察到B6小鼠回肠的上皮细胞脱落、绒毛变钝和固有层水肿，这些现象在Trif-/-小鼠身上有所减轻（图3H）。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和TNF注射的Trif-/-小鼠中都发现了粘膜水肿，并被解释为TRIF缺乏的小鼠的潜在背景变化。然而，与B6不同的是，在没有TRIF的情况下，TNF注射并没有增加水肿的严重程度或发生率。注射TNF后4小时，B6肠道的进一步放大显示白细胞（主要是中性粒细胞）浸润增加，而在TNF处理的TRIF缺陷动物中则没有（图3H）。同样，在B6小鼠的肝脏中观察到白细胞浸润增加，在较小程度上，Trif-/-小鼠对TNF的反应也是如此（图3I）。此外，尽管Trif-/-小鼠的脾脏在注射TNF后6小时看起来大体正常，但B6脾脏表现出相当大的变黑，表明有组织损伤（图3J）。为此，B6脾脏表现出红细胞浆充血的证据，在没有TRIF的情况下，红细胞浆充血的情况有所缓解。此外，TNF诱导的脾细胞死亡在Trif-/-小鼠中明显减少，终端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（TUNEL）染色证明了这一点（图3，K和L）。为了支持TRIF途径不仅在调节细胞死亡，而且在脾脏的炎症反应中发挥作用，Trif-/-、Cd14-/-和Trif-/Cd14-/-小鼠的脾脏TNF和IFN-β水平明显减弱。与B6相比，Tlr3-/-、Tlr4-/-和Tlr3-/-Tlr4-/-小鼠脾脏中的细胞因子水平略有升高，这表明TLR3和TLR4可能封存TRIF，抑制了对TNF的反应。

4.TRIF介导的TNF诱导的细胞死亡的细胞依赖性

为了确定依靠TRIF介导TNF诱导的脾脏形态和免疫细胞浸润的细胞（图3J），在注射TNF 4小时后对小鼠脾脏进行了单细胞RNA测序。确定了八个细胞簇，包括一个具有脾脏红浆巨噬细胞（RPMs）和红细胞的标记物组合的细胞簇（图4A）。RPMs在吞噬受损和衰老的红细胞中起着关键作用，并在应对各种血源性病原体时产生I型IFNs。再加上我们的脾脏样本中存在的红细胞在测序前被裂解，这个集群可能代表了含有吞噬红细胞的RPM（图4A）。B细胞、T细胞和树突状细胞群的比例在TNF给药后基本保持不变（图4，B和C）。然而，在Trif-/-而不是B6脾脏中，RPM、中性粒细胞和巨噬细胞群的比例在对TNF的反应中扩大，支持TRIF在这些细胞亚群的体内TNF反应中的作用，并表明免疫细胞在没有压倒性细胞死亡的情况下被招募到脾脏和/或增殖（图4，B和C）。一些细胞亚群如单核细胞和自然杀伤（NK）细胞对TNF的反应与TRIF无关，进一步表明TRIF对TNF的依赖性反应可能是细胞类型特异的（图4，B和C）。注射TNF 4小时后对小鼠脾脏的流式细胞仪分析显示，巨噬细胞和中性粒细胞的数量在B6小鼠脾脏中明显减少，在Trif-/-小鼠脾脏中对TNF的反应增加（图4D）。相比之下，不同基因型的B细胞和T细胞的数量在对TNF的反应中基本保持一致（图4D）。虽然我们的SCS数据表明，NK细胞以TRIF不依赖的方式对TNF作出反应，但流式细胞仪分析表明，与巨噬细胞和中性粒细胞相似，NK细胞的反应也依赖于TRIF（图4D）。

为了进一步证实TRIF依赖性的TNF反应与TRIF和CD14的表达相关，CD14专门在巨噬细胞和中性粒细胞群中高度表达（图4E），这表明TNF反应对TRIF的依赖性是在具有高水平CD14的细胞中观察的。为了确定对TNF反应特别依赖TRIF的途径，我们比较了每个集群依赖TRIF的GO富集（图4F）。特别值得注意的是为巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞群确定的GO术语，包括 "NOD-、LRR-和含吡啶域蛋白3（NLRP3）炎症体复合物的组装"、"细胞对LPS的反应 "和 "外在的凋亡信号通路"（图4F）。这些数据表明，到目前为止，TRIF被认为只对TLR介导的反应有贡献，它通过驱动炎症细胞因子的产生和随后的细胞死亡，促进了TNF诱导的体内死亡，可能是特定细胞群的死亡。此外，这些发现强调了平衡免疫反应的重要性，因为在Trif-/-小鼠中观察到的低水平的细胞因子产生（图3，C至E）足以促进脾脏中免疫细胞的招募和/或增殖（图4，B至D），而不会驱动大量细胞死亡（图3，F至K）和动物致死（图3，A和B）。

5.造血细胞是TRIF介导的TNF反应的效应细胞

为了确定以TRIF依赖性方式对TNF作出反应的细胞亚群，我们用CD45.2 B6或Trif-/-供体的BM重组了受致命照射的CD45.1 B6小鼠。监测小鼠体温（图5A）显示，造血细胞赋予了TRIF依赖的TNF致死表型。也就是说，当小鼠用B6 BM重组时，它们会被TNF致死，而用Trif-/- BM重组的小鼠则受到高度保护（图5A）。所有受体小鼠，无论BM基因型如何，都表现出早期的温度下降，这让人想起在所有小鼠中观察到的温度下降，无论基因型如何（除了Tnfr1-/-小鼠），表明早期细胞对TNF的反应并不依赖于TRIF（图3A和5A）。为了进一步支持TRIF在造血细胞中的重要性，与B6 BM小鼠相比，Trif-/-BM小鼠的血清细胞因子、LDH和ALT水平减弱了，这表明造血细胞中的TRIF活性对TNF的炎症和细胞死亡反应至关重要（图5，B至D）。最后，在B6 BM小鼠回肠中观察到的绒毛变钝和固有层水肿在Trif-/-BM小鼠中被废除，表明造血细胞以TRIF依赖的方式在TNF致死的背景下对肠道损伤做出了贡献（图5E和）。肠道损伤可能是由B6而不是Trif-/-肠道中的中性粒细胞招募增加引起的，增加了局部炎症并驱动细胞死亡和坏死（图3H）。B6 BM脾脏的组织学显示出淋巴区的减少和红髓充血的证据，在造血细胞没有TRIF的情况下，红髓充血的情况会减少。此外，与B6 BM小鼠相比，Trif-/- BM中TNF诱导的脾细胞死亡明显减少（图5，F和G）。这些发现表明，造血细胞赋予了TRIF依赖性的细胞死亡和对TNF的炎症反应，并在TNF致死的情况下大大促进了在肠道和脾脏观察到的病理学。

6.中性粒细胞介导炎症反应而巨噬细胞介导细胞死亡

为了确定哪些造血细胞以TRIF依赖的方式介导TNF毒性，我们观察到Rag-/-小鼠对TNF毒性没有抵抗力，这表明B和T细胞并没有赋予对TNF的敏感性。与B6相比，Rag-/-小鼠表现出低体温加剧和血清细胞因子水平升高。鉴于以前的报告说适应性免疫细胞在抑制TNF依赖的先天性免疫反应中起作用，这些结果是预期的。相反，用单克隆Ly6G抗体1A8耗尽中性粒细胞会延迟并降低B6小鼠的致死率（图6，A和B），表明中性粒细胞在TNF致死中的作用。为了确定中性粒细胞是否专门负责TRIF依赖性的TNF反应，我们进行了一个功能增益实验，用B6或Trif-/中性粒细胞重组耐TNF的Trif-/-小鼠。用B6而不是Trif-/-中性粒细胞重组的小鼠易受TNF致死的影响，进一步表明中性粒细胞可能以TRIF依赖的方式对TNF致死做出贡献（图6C）。由于巨噬细胞和中性粒细胞在我们的SCS分析中表现出类似的群体变化和TRIF依赖性途径，我们进行了类似的功能增益实验，其中Trif-/-小鼠与B6或Trif-/-巨噬细胞进行重组（图6C）。与中性粒细胞类似，用B6而不是Trif-/-巨噬细胞重组的小鼠获得了对TNF的敏感性（图6C）。虽然加入B6中性粒细胞增强了血清TNF和IFN-β水平，但对血清IL-1β、LDH或ALT水平几乎没有影响（图6，D至F）。相反，血清中IL-1β、LDH和ALT的积累似乎以TRIF依赖的方式依赖于巨噬细胞（图6，D至F）。这一发现得到了我们SCS数据的支持，其中与 "IL-1生产 "和NLRP3炎症体复合体组装相关的基因在巨噬细胞群体中被特别富集（图4F）。这些数据进一步表明，中性粒细胞负责对TNF的TRIF依赖性炎症反应，而对TNF的细胞死亡反应是在巨噬细胞水平上调节的。

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