    上期回顾请点击：【Nature Protocols】系列：利用人类多能干细胞生成肺类器官（上） 今天小学社将为大家详细讲解本研究中实验操作的20项具体步骤。  关键正确维护 hPSCs 对成功完成本方案至关重要。必须密切监测接种密度和集落大小，以确保不会发生过早分化。请参见图 3 和图 4，以获得直观指导。请注意，我们不使用饲养层来维持 hPSCs。  图3 人多能干细胞的分裂和定向分化。a-f，时间线示意图和实验步骤。g-i，生长和分裂过程中造血干细胞的明场图像。插图是在相同的放大倍数下拍摄的倒置图像，以帮助可视化细胞密度和集落形状。比例尺，1mm或100µm。g，明场图像显示适当的融合和健康的集落形状。这些细胞准备分裂。b、清洗细胞，用细胞刮板刮干净，并用血清学移液管机械分离菌落。h,明场图像显示悬浮中适当大小的破碎集落。这些细胞已经准备好播种到24孔板上。c、将细胞植入24孔板。i，明场图像显示漂浮的集落。这些集落均匀地分布在整个井中，可以放在培养箱中过夜。播种24 h后，菌落应覆盖井底约50%，且分散均匀。d、开始内胚层分化程序。j - 1，明场图像显示单层细胞的典型形态低倍镜下的整个内胚层分化(j，上排;比例尺，1mm)或在倒置显微镜下更高的放大倍率(j，底部一行;比例尺，100µm)。e，开始前肠分化方案。k，明场图像显示前肠分化过程中单层细胞的典型形态。前肠球体在前肠分化的第3-4天左右开始形成(k，上排，白色箭头)。通过解剖镜低倍显示(k，上排;比例尺，1mm)和倒置显微镜下更高倍率(k，下一行;比例尺，100µm)。1、数字放大图像显示分化方案第8天培养板上的前肠球体。f、收集浮球，与Matrigel混合，在24孔板上形成液滴  图4 常见错误和问题排除。a、分裂前，检查板上无明显分化集落。在将人造血干细胞分裂成24孔板之前，使用无菌吸管尖刮掉任何异常集落。箭头表示hPSC分化区域，可见凸起的白色结构，分裂前应刮掉。比例尺，1 mm. b，分离hPSC集落时，确保集落破碎到足够小的尺寸。这些图像显示的蜂群仍然太大。在分裂细胞之前，继续分解集落。鳞片，1 mm. c，将hPSC集落置于24孔培养皿中后，在解剖显微镜下用力摇动培养皿，确保细胞均匀分散。在这张图像中，大多数细胞仍然聚集在孔的中心。这将导致不均匀的生长模式，分化不会产生球体。在继续分化前摇动细胞。d，低倍明场图像(上排;比例尺，1mm)和高倍(下排;比例尺，100µm)放大显示分化第0天的培养条件可能无法形成球体。如果种子密度过低或过高，或者由于hPSC菌落在分裂后没有得到充分的剪切而导致菌落大小过大，则分化方案将无法成功。高密度播种柱上的箭头表示细胞在井的中心已经融合，这将导致分化不均匀，并且可能无法产生前肠球体。 关键 该方案是针对在涂有100mg/mL基底膜生长因子还原Matrigel的六孔组织培养皿中培养的hPSCs开发和优化的，每天 mTeSR™1喂养。日常维护时，细胞保存在95% 空气和5% CO2的组织培养级培养箱中，并在无菌环境中进行维护。 另外，也可将六孔板的一个孔分成六孔，以维持 hPSCs。   关键在整个过程中确保无菌技术和无菌环境。此过程通常在配有体视显微镜的层流罩或配有体视显微镜的半无菌罩中进行。  ●时间 具有气道样结构和周围间质的类器官需要约50天生长，最适合在第50-85天使用，因为此时类器官具有最多的气道样结构。它们需要每2-3周重新嵌入新鲜的Matrigel中。 ● 时间安排 纯上皮细胞囊肿将在约 2 周后形成，并将包含几乎均质的芽尖祖细胞群。如果培养不均匀，可在此时点（2 周）用手分离出具有清晰上皮囊状结构的类器官。这种上皮器官样细胞群可通过连续针传代培养 120 多天来维持和扩大。 ● 时间安排 纯上皮细胞囊肿将在约 2 周后形成，并将包含几乎均质的芽尖祖细胞群。要生成具有离散芽尖和气道样区域的模式化肺类器官，应在传代过程中保持其结构完整。未进行针刺传代的芽尖祖细胞类器官在培养约 6 周后，将形成芽状上皮结构和近端-远端模式化元素，以及结构内部的功能性粘液分泌细胞。 关键 芽尖原基类器官如果不进行针刺传代，就会向类器官腔内分泌粘液，造成外观致密，导致细胞死亡增加；因此，必须定期清理这些类器官。 参考信息 Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.Nat Protoc. 2019 Feb;14(2):518-540. doi: 10.1038/s41596-018-0104-8.PMID: 30664680 PMCID: PMC6531049. |
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