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结核病( tuberculosis，TB) 是由结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB )引起的传染 病。结核分枝杆菌（MTB）俗称结核杆菌（tubercle bacillus），菌细长略弯曲，有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列，无鞭毛、无芽胞，有荚膜。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。MTB革兰染色阳性，不产生内外毒素。
Genome of M. tuberculosis 结核分枝杆菌基因组大小为4.4 Mb，基因组G/C含量高达65.6%，预测含4411个开放阅读框(ORF)，其中3924个ORF被认为编码蛋白质，50个基因编码稳定的RNA。如由MTB Rv3875基因编码的早期分泌抗原靶6 kDa蛋白(early secretory antigenic target of 6 kDa, ESAT-6)能诱导强烈的T细胞免疫应答，并提供一定的抗结核免疫保护；Rv3804c基因编码的Ag85A蛋白是MTB的主要分泌蛋白Ag85复合物成分之一，可使细胞毒性T细胞的细胞毒活力升高；Rv2660c基因编码的蛋白在MTB处于休眠状态时仍能持续表达，提示Rv2660c基因可作为清除潜伏性感染阶段MTB的作用靶点；Rv3428c位于MTB的RD11 区，编码插入序列IS1532 的转座酶，可引起体内的细胞与体液免疫，Rv3428c编码的重组蛋白具有增加γ－干扰素在小鼠中的表达潜力，可作开发结核疫苗的融合抗原。有研究表明Rv3428c重组蛋白有较高的临床应用价值，Rv3428c的重组蛋白辅助诊断阴性菌的肺结核有81. 5%灵敏度和82. 0%特异度。
为进一步探讨Rv3428c在MTB特异性诊断中的研究价值，来自四川大学华西公共卫生学院的研究人员通过同源重组得到pET28a-Rv3428c表达载体，转入E. coli BL21( DE3)后进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠后进行细胞融合，间接ELISA、Western Blot筛选阳性杂交瘤细胞系，以筛选获得的阳性杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水，蛋白A亲和层析法纯化抗体，BCA法测定浓度，ELISA和SDS-PAGE进行单克隆抗体的鉴定及亚型和效价的测定。
Construction and identification of pET28a－Rv3428c vector 普健生物拥有十余年的重组蛋白表达和杂交瘤细胞单克隆抗体制备经验，经过不断的探索和改进，开发了建立了3H（High through、High efficiency、High quality）大肠杆菌表达系统，拥有独特的表达纯化及复性平台，95%以上的超高蛋白表达成功率，已成功交付上万例大肠杆菌表达服务项目。如果您有大肠杆菌重组蛋白表达与纯化项目需求，欢迎联系027-87001869与我们的专员进行沟通！此外，普健生物长期为国内外科研机构，IVD企业，抗体药物企业提供抗体发现技术服务，积累丰富的抗体开发经验，可以提供DNA免疫，多肽、蛋白免疫，小分子免疫；高通量定制化抗体筛选方案；ELISA、WB、IF、IHC、FC、Biacore 等多样性高通量检测平台以及杂交瘤测序技术和重组抗体表达服务。如果您有杂交瘤抗体制备需求或相关技术咨询，欢迎联系027-87001869共同交流探讨！
最终测序结果表明，插入序列与MTB H37Rv基因组Rv3428c公布的序列一致，表明原核表达载体构建成功。对重组蛋白进行大量表达与纯化，纯化的重组蛋白使用超滤管进行超滤浓缩，SDS－PAGE分析目的蛋白的表达。
Abundantly expression and purification of pET28a－Rv3428c recombinant protein 随后，通过Western blot筛选出一株效果好的阳性杂交瘤细胞株，通过体内诱生法制备获得Rv3428c单克隆抗体。该单抗属于IgG2a亚类，κ型轻链，效价约为1∶128000，浓度为4 mg /ml。
Purification and identification of Anti－Rv3428c Monoclonal Antibody
Determination of purified anti－Rv3428c－mAb titer by ELISA
Identification of monoclonal antibody subtypes by ELISA
Identification of Anti-Rv3428c Monoclonal Antibody Subtypes 关于MTB诊断抗原的研究有很多，但应用于检测抗原的研究相对比较空白。Rv3428c特异性地在结核分枝杆菌中表达，其他分枝杆菌中不存在该基因，因此特异性好。这项研究成功构建了MTB的RD11区Rv3428c 表达载体，大量表达并纯化蛋白，成功制备Rv3428c单克隆抗体。为后续探索其在临床样本中的应用价值，为临床MTB快速抗原检测试剂盒提供参考，为寻找早期、方便快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法奠定基础。
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