【原】小鼠糖尿病肾病(DKD)的单细胞转录组图谱-1

健明 2024-07-02 发布于广东

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文章概述

文章标题：《Mapping the Single Cell Transcriptomic Response of Murine Diabetic Kidney Disease to Therapies》

发表日期和杂志：2022年发表在Cell Metabolism上

在线阅读链接：https:///10.1016/j.cmet.2022.05.010

疾病简介

糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿病并发症中最常见的一种，也是导致终末期肾病（End Stage Renal Disease，ESRD）的主要原因，可导致肾衰竭、心血管疾病和早死。DKD的发生与糖尿病患者的血糖控制不良、高血压、遗传因素等多种因素有关。

DKD的主要病理特征包括肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维化等。临床上，DKD主要表现为持续性蛋白尿、血肌酐升高、肾功能逐渐下降等。

DKD的治疗主要包括控制血糖、降低血压、改善蛋白尿等。在疾病晚期，可能需要进行透析或肾脏移植。

单细胞实验设计

研究目的：通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，分析小鼠DKD模型对五种治疗方案的反应，以期理解DKD的细胞和分子驱动因素，以及不同药物如何保护肾脏免受DKD的进展。

单细胞实验设计：

使用了db/db小鼠模型，这些小鼠经过单侧肾切除手术并引入了肾素诱导的高血压，以模拟人类糖尿病肾病（DKD）的进展。
研究比较了五种不同的治疗方案：对照组（给予载体）、ACE抑制剂、罗格列酮（一种降糖药）、SGLT2抑制剂、ACE抑制剂与罗格列酮联合治疗以及ACE抑制剂与SGLT2抑制剂联合治疗。这些治疗在两个时间点（2天和2周）进行了评估。
研究涵盖了70只小鼠，这些小鼠被分为14个不同的组别，每组包含4到6只小鼠。生成了来自所有组别的单核RNA测序（snRNA-seq）数据集，涵盖了近100万个细胞。

单细胞转录组数据情况

数据链接是：https://www.ncbi.nlm./geo/query/acc.cgi?acc=GSE184652

样品详情：总共是70个样品

数据情况：

提供的都是h5格式的的二进制文件，可以使用Read10X()函数读取，然后创建seurat对象进行后续的降维聚类分群

不过因为数据量过大，百万数量集的单细胞数据，用我们自己的个人计算机肯定是跑不动的！我们可以参考一下拆分你的百万级别单细胞数据集后做降维聚类分群

推文里是对855271个细胞，平等的拆分成为了两个矩阵后各自构建了Seurat对象，后续只需要对两个 sce.all 变量走我们的降维聚类分群流程即可

那糖尿病肾病单细胞数据是70只小鼠，这些小鼠被分为14个不同的组别，每组包含4到6只小鼠，我们其实可以按照14个组别对单细胞数据进行拆分，然后基于文章提供的GSE184652_metadata.csv.gz注释信息，给每个细胞亚群命名

后续挑选里面的具体的某个单细胞亚群，然后对它继续细致的降维聚类分群后讨论它的临床意义即可。

文章单细胞分析流程

文章源代码：https://github.com/TheHumphreysLab/Mouse_DKD_Rx_Atlas

数据预处理：

使用CellBender去除环境RNA污染。
使用DoubletFinder去除潜在的双细胞污染，根据Demultiplexlet研究估算nExp参数。

批次效应校正和细胞聚类：

使用Seurat进行批次效应校正和聚类分析，采用基于参考样本的方法，选择健康组样本作为“参考”，其他作为“查询”数据集。
执行PCA、UMAP等联合分析，根据标记基因表达注释细胞簇，并手动移除表达混淆的细胞簇。
排除了因数量变异大而可能影响分析的tAL细胞类型。

差异基因分析：

使用Seurat的FindAllMarkers和FindMarkers功能识别细胞类型特异性标记和疾病相关基因。
对比不同组别的基因表达，识别治疗恢复的疾病基因。

通路和基因本体（Gene Ontology, GO）分析：

使用fgsea R包进行通路分析，使用MSigDB、Hallmark和Reactome数据库。
使用topGO包进行GO分析，排除基因数过多或过少的GO术语。

文章主要结果简介

小鼠肾脏的细胞异质性

通过向单侧肾切除的db/db小鼠注射携带肾素基因的腺相关病毒（ReninAAV），诱导了糖尿病肾病（DKD）

生理测量证实，与传统的db/db模型相比，ReninAAV模型出现了更严重的蛋白尿、高血压和组织病理学改变

研究设计包括六个组别：

db/m（对照组）
db/db（给予载体）
db/db + 利司普利（ACE抑制剂，ACEi）
db/db + 罗格列酮（降糖药，Rosi）
db/db + JNJ-39933673（SGLT2抑制剂，SGLT2i）
db/db + 利司普利 + 罗格列酮（ACEi + Rosi）
db/db + 利司普利 + JNJ39933673（ACEi + SGLT2i）

生理学数据展示经过两周的治疗的结果与与每类药物的预期治疗效果一致：

接受ACE抑制剂（单独或与罗格列酮或SGLT2抑制剂联合）的小鼠以及单独接受罗格列酮治疗的小鼠，在尿白蛋白与肌酐比值（UACR）上均有显著降低。
单独接受ACE抑制剂或与之联合治疗的所有小鼠均有显著的血压降低，而单独接受罗格列酮或SGLT2抑制剂治疗的小鼠则没有。
只有在罗格列酮+ACE抑制剂和SGLT2抑制剂治疗组中才实现了血清葡萄糖的显著降低。

单细胞第一层次降维聚类分群及细分

在两个早期时间点(治疗后2天和2周)收集组织，以确定这些治疗的最接近效果，并使用10x Chromium平台对14组70只小鼠的肾脏进行snRNA-seq。

总共获得了946660个高质量的单个细胞，这些细胞被分为18种主要的肾细胞类型。

每个实验组、小鼠和时间点都为每个簇贡献细胞，表明各组间不存在解离偏差。

每种细胞类型都独特地表达了预期的细胞定义标记基因，也反映了经过质量控制的数据的高质量

平均每个细胞检测到1167个独特基因和2105个转录本

其中包括罕见的细胞类型，如2,421个致密斑（MD）细胞和2,783个来自肾小球旁器（JGA）的肾素阳性细胞。

小鼠肾脏中的多种细胞类型表现出显著的异质性，尤其是在以下几种细胞类型中：

内皮细胞：发现了6种不同的内皮细胞亚型，包括表达Ehd3的肾小球内皮细胞。这些亚型的鉴定是通过将其分子特征与公共内皮细胞单细胞图谱中报告的数据进行对比实现的。
免疫细胞：尽管在snRNA-seq数据集中相对不足，还是能够鉴定出T细胞、巨噬细胞和树突细胞。
亨氏袢(TAL)厚升肢亚群：7种不同的TAL亚型，包括三个不同的髓质TAL亚簇、三个不同的皮层亚簇以及表达Nos1的致密斑（MD）细胞，所有这些都表达独特的标记基因。
成纤维细胞：鉴定出三种成纤维细胞亚簇，包括表达Acta2的肌成纤维细胞亚簇，以及表达Dkk2和Col8a1的两种成纤维细胞亚型，这些亚型也在其他器官如膀胱中被发现。