斑马鱼作为一类脊椎模式动物,具备体型小、繁殖率高、传代周期短、体外受精发育、胚胎透明、饲养管理方便等优势,在毒理学研究领域发挥着越来越重要的作用。同时斑马鱼的胎心类似于人类胚胎的心脏,分为心房和心室,房室之间有瓣膜,因而为研究人类心血管系统提供了一类较好的模型。而且,斑马鱼幼鱼早期发育存活不完全依赖于血液循环,可用显微镜直接观察活鱼卵心脏的明显形态和功能缺陷,或通过分子标记物来识别细微差别。胚胎透明易观察等优点,在高通量筛选、毒理学研究方面有其独特优势。斑马鱼在发育初期完全透明,荧光转基因斑马鱼cmlc2:GFP及gz15Tg/+(AB)使得心脏及肝脏形态观察更加方便,并广泛用于毒理学研究。以荧光转基因斑马鱼为模型,可进行发育毒性、心脏毒性、肝脏毒性、肾脏毒性进行观察评价。 ![]() 欢迎加入 斑马鱼行为实验交流群 扫码邀请入群 雌雄斑马鱼培养于28℃水循环系统中,交配产卵时,于前1日下午将雌雄斑马鱼按1∶1置于交配缸中并用隔板隔开。次日早上抽取隔板进行交配,抽取隔板1h后收集受精卵,除去杂物、死卵、未受精卵后,将健康的受精卵置于28℃培养箱中培养。 例:交泰丸水提物(黄连-肉桂10∶1)制备 取肉桂粗粉10g,加8倍水浸泡1h,蒸馏5h,收集挥发油,蒸馏后的水溶液滤过另器收集;取黄连粗粉100g,用10倍量的水浸泡1h,肉桂药渣和黄连煎煮3次,第1次2h,第2次1.5h,第3次1h。滤过,合并滤液与上述蒸馏水溶液,常压浓缩至1mL相当于原药材1.2g,将浓缩液在60℃水浴蒸发水分得稠膏。干燥(60℃)36h,干膏研成粉末状,将肉桂挥发油与干膏粉混匀为实验药品,置4℃冰箱保存。临用时精密称取实验药品约10mg,用5%DMSO水溶液溶解成50mg·L-1的储备液,超声30min溶解,配制完成后4℃冰箱保存备用,实验前涡旋仪混匀,用5%DMSO水溶液稀释至实验所需浓度。稀释后将药物混悬液按1∶9的比例加入胚胎水中。 斑马鱼胚胎半数致死量(LD50)的测定 显微镜下选取正常发育受精后4dpf的斑马鱼胚胎,并将其随机转移到含有培养液和不同浓度样品溶液的24孔板中,每孔10枚胚胎,设3个复孔。置于28℃恒温培养箱中培养,每隔24h更换1次含药培养液,培育至7dpf。根据预实验,设置7个给药浓度,另设空白组,每个浓度3个复孔,给药后每24h观察斑马鱼胚胎孵化及死亡情况并记录,重复3次实验。实验完成后,整理数据并进行分析,绘制量-毒曲线图,计算LD50。 斑马鱼胚胎形态学测定 处理后72h的斑马鱼胚胎,移去含药培养液,用胚胎培养水清洗3次后转移至盛有3%甲基纤维素钠水溶液的培养盘中,于体视显微镜下拍照,并用Dianoscope软件进行分析,对斑马鱼胚胎的体长,眼睛大小进行测量。 斑马鱼胚胎心脏毒性评价 将不同给药组处理后72h的斑马鱼胚胎,移去含药培养液,用胚胎培养水清洗3次后转移至盛有3%甲基纤维素钠水溶液的培养盘中,于体视显微镜下观察并录制视频,并用Dianoscope软件进行分析。 将不同给药组处理后72h的斑马鱼胚胎,移去含药培养液,用胚胎培养水清洗3次后转移至盛有3%甲基纤维素钠水溶液的培养盘中,并加入适量鱼安定,使心脏停止跳动,于体视显微镜下观察并拍照。拍照后固定,用共聚焦扫描显微镜对斑马鱼心脏进行拍照,并利用ImageJ软件对静脉窦-动脉球(SV-BA)间距,心包、心房、心室面积,瓣膜间距(AVchannel)及入血口(Inflow)距离进行统计分析。 斑马鱼幼鱼肝肾毒性测定 选取低于LD0的3个浓度,另增加何首乌提取物100mg·L-1及马兜铃酸8mg·L-1组作为阳性药组。处理后72h的斑马鱼幼鱼,移去含药培养液,用胚胎培养水清洗3次后转移至盛有3%甲基纤维素钠水溶液的培养盘中,于荧光显微镜下拍照。 斑马鱼幼鱼肝、肾生化指标测定 显微镜下选取正常发育受精后4dpf的斑马鱼胚胎,并将其随机转移到含有培养液和不同浓度样品溶液的12孔板中,每孔30枚胚胎,设3个复孔,给药浓度同2.5.1项。置于28℃恒温培养箱中培养,每隔24h更换1次含药培养液,培育至7dpf,移去含药培养液,用胚胎培养水清洗3次后转移至1.5mL离心管中,吸干水分后迅速转移至干冰中,待斑马鱼幼鱼完全冷冻后再转移至-80℃冰箱中保存,随后按照试剂盒的相关步骤进行ALT,AST酶活性测定及肌酐含量测定。 交泰丸水提物对斑马鱼胚胎的量-毒曲线 对斑马鱼胚胎生长发育的影响空白组斑马鱼胚胎发育正常,状态良好,无死亡现象。与空白组比较,交泰丸各给药组,125mg·L-1未见明显形态学改变,250,500mg·L-1给药组可以观察到头部变小,体长变短,眼睛半径减小,表明交泰丸水提物可延缓发育,且呈一定的剂量依赖性。 往期推荐 脑声笔记︱斑马鱼行为篇①:斑马鱼嗅觉行为学和简单运动行为学研究 脑声笔记︱斑马鱼行为篇②:斑马鱼在帕金森病研究中的应用 脑声笔记︱斑马鱼行为篇③:斑马鱼视觉行为学实验相关研究 【元旦快乐】脑声笔记︱斑马鱼行为篇④:斑马鱼攻击行为测试方法总结 脑声笔记︱斑马鱼行为篇⑤:斑马鱼的条件位置偏好行为范式 脑声笔记︱斑马鱼行为篇⑥:斑马鱼逃避反应测试 脑声笔记︱斑马鱼行为篇⑦:斑马鱼T迷宫行为学检测 脑声笔记︱斑马鱼行为篇⑧:斑马鱼失眠模型及评价方法 脑声笔记︱斑马鱼行为篇⑨:斑马鱼新型水箱测试(Noval tank test,NTT) 脑声笔记︱斑马鱼行为篇⑩:斑马鱼慢性不可预测应激(CUS)范式 斑马鱼行为篇㉚:浅析斑马鱼捕食和避害行为 斑马鱼行为篇㉛:浅析斑马鱼氧化应激 斑马鱼行为篇㉜:斑马鱼反捕食行为测试 斑马鱼行为篇㉝:斑马鱼白血病模型 斑马鱼行为篇㉞:斑马鱼酒精肝模型 斑马鱼行为篇㉟:斑马鱼幼鱼社交行为 斑马鱼行为篇㊱:斑马鱼睡眠剥夺模型 斑马鱼行为篇㊲:斑马鱼在环境毒理学测试中应用 斑马鱼行为篇㊳:斑马鱼听觉功能研究 斑马鱼行为篇㊴:斑马鱼肝纤维化模型 斑马鱼行为篇㊵:炎症性肠病相关斑马鱼模型 斑马鱼行为篇(54):斑马鱼焦虑行为测试 斑马鱼行为篇(55):斑马鱼幼鱼相关行为范式 斑马鱼行为篇(56):环境雌激素影响雄性斑马鱼繁殖行为 斑马鱼行为篇(57):斑马鱼在心血管疾病中应用 参考文献: 1、Cardiogenesis impairment promoted by bisphenol A exposure is successfully counteracted by epigallocatechin gallate[J]. Marta Lombó;;Silvia González-Rojo;;Cristina Fernández-Díez;;María Paz Herráez.Environmental Pollution,2019 2、Cardiotoxicity evaluation of nine alkaloids from Rhizoma Coptis[J]. MY Zhang;;YY Yu;;SF Wang;;Q Zhang;;HW Wu;;JY Wei;;W Yang;;SY Li;;HJ Yang.Human and Experimental Toxicology,2018(2) 3、张明哲,陈章美,莫柳英,等.基于斑马鱼模型的交泰丸安全性评价[J].中国实验方剂学杂志,2020,26(18):51-57. ![]() 找实验方法,上脑声常谈 ![]() 方法检索教程 |
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