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核酸浓度的测定是分子生物学实验中的基础操作之一，它直接关系到后续实验的成功与否。不同的实验目的和样品类型需要选择不同的测定方法。本文将详细介绍几种主流的核酸浓度测定方法，包括定磷法、定糖法、紫外吸收法、荧光光度法以及qPCR法等。 一、定磷法 1. 原理 定磷法是基于核酸分子中磷元素的含量相对稳定的特性进行测定的。在酸性环境中，核酸中的磷元素与定磷试剂（如钼酸铵）反应生成磷钼酸，后者在还原剂作用下转变为蓝色的钼蓝化合物。钼蓝在特定波长（如650-660nm）下具有最大吸收峰，其吸光度与核酸中磷的含量成正比，从而间接反映核酸的浓度。 2. 操作步骤 （1）样品处理：根据样品类型进行适当的前处理，如提取、纯化等。 （2）酸解：将样品置于酸性环境中，使核酸完全水解为核苷酸和磷酸等小分子。 （3）显色反应：加入定磷试剂和还原剂，使磷元素转化为钼蓝化合物。 （4）比色测定：使用分光光度计在特定波长下测定吸光度，根据标准曲线计算核酸浓度。 3. 优缺点 优点：方法简单、快速，灵敏度较高。 缺点：易受蛋白质和核苷酸等杂质的干扰，影响测定结果的准确性。 4. 应用范围 定磷法适用于对核酸含量进行粗略估计的场合，如科研中的初步筛选或教学实验中的演示等。测定范围在1-10μg 二、定糖法 1. 原理 定糖法是利用核酸分子中戊糖（核糖或脱氧核糖）在酸性条件下脱水生成醛类化合物的特性进行测定的。这些醛类化合物可与某些成色剂（如间苯二酚）反应生成有色化合物，其颜色深浅与核酸中戊糖的含量成正比，从而间接反映核酸的浓度。 2. 操作步骤 （1）样品处理：同定磷法。 （2）酸解：使核酸水解为戊糖等小分子。 （3）显色反应：加入成色剂进行显色反应。 （4）比色测定：使用分光光度计测定吸光度，根据标准曲线计算核酸浓度。 3. 优缺点 优点：操作相对简单，对设备要求不高。 缺点：特异性较差，易受其他糖类及其衍生物、醛类和蛋白质的干扰。 4. 应用范围 定糖法同样适用于对核酸含量进行初步估计的场合，但其准确性低于定磷法和紫外吸收法等方法。测定范围在20~250μg 三、紫外吸收法 1. 原理 紫外吸收法是基于核酸分子中碱基（如嘌呤和嘧啶）在紫外光区（特别是260nm处）具有强吸收特性的原理进行测定的。通过测定核酸溶液在260nm处的吸光度（A260），结合朗伯比尔定律（A=εcb），可计算出核酸的浓度。 2. 操作步骤 （1）样品准备：将核酸样品溶解于适当的缓冲液中，确保浓度在可测定范围内。 （2）基线校正：使用分光光度计进行基线校正，消除仪器误差。 （3）测定吸光度：将核酸样品置于分光光度计中，测定260nm处的吸光度。 （4）计算浓度：根据吸光度值和已知的摩尔吸光系数（ε），利用朗伯比尔定律计算出核酸的浓度。
核酸和蛋白质等的吸收光光谱（来源：网络） 3. 优缺点 优点：操作简便、快速，灵敏度高，是实验室中最常用的核酸浓度测定方法之一。 缺点：只适用于测定浓度大于0.25ng/ul，无法区分DNA和RNA，且易受降解核酸、游离核苷酸及其他杂质的干扰。 4. 应用范围 紫外吸收法广泛应用于分子生物学实验中的核酸浓度测定，包括PCR产物分析、质粒提取效果评估、RNA提取质量检测等。 四、荧光光度法 1. 原理 荧光光度法是利用荧光染料与核酸分子结合后产生的荧光信号进行测定的。这些荧光染料（如SYBR Green、PicoGreen等）在特定波长光源激发下能发出荧光，且荧光强度与结合的核酸分子数量成正比。通过测定荧光强度，可定量核酸的浓度。 2. 操作步骤 （1）样品准备：同紫外吸收法。 （2）荧光染料结合：向核酸样品中加入适量的荧光染料，充分混合使染料与核酸分子结合。 （3）荧光测定：使用荧光分光光度计或荧光定量PCR仪等仪器测定荧光强度。 （4）计算浓度：根据荧光强度值和已知的标准曲线计算出核酸的浓度。
Qubit荧光计检测流程（来源：网络） |
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