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结果： 为了将转录组学数据与组织病理学和临床变量相结合，进行WGCNA以促进与炎症评分相关的基因共表达模块的鉴定。最初，根据层次聚类分析删除了两个异常值样本。因此，该研究包括 21 个 IPAH 和 4 个具有完整临床数据的对照样本（附加文件 3，表 S0），中位炎症评分为 60.0 （26.0–74.0）。值得注意的是，Spearman分析显示，炎症评分与IPAH患者的平均肺动脉压（mPAP，R=42.0，p=039.0）和肺血管阻力（PVR，R=46.0，p=023） 呈显著正相关。根据最优无标度拟合指数和平均连通性，将软阈值（功效）确定为 10，从而鉴定出27个基因共表达模块。根据Pearson相关性分析，绿色模块（包含665个基因）与炎症评分具有很强的相关性（相关系数= 0.69，p = 2e-04）。此外，该模块内的模块成员资格 （MM） 和基因显着性 （GS） 之间也观察到显着相关性（相关系数 = 0.59，p = 1.3e-63）。综上所述，由于一组基因与临床相关的炎症评分有关，因此已从转录组数据中分离出一组基因。
鉴于潜在重要的基因可能在患病组织中显示表达水平的改变，因此进行了差异表达分析。对所有 45 个样品的基因表达谱进行归一化。将IPAH样品与正常对照进行比较，得到288个DEGs，为了分离与炎症评分相关的DEGs，288个DEGs与WGCNA衍生的炎症评分模块相交，产生22个基因,进行GO功能和KEGG通路分析，以描绘这22个炎症相关基因的潜在作用。正如预期的那样，GO分析表明免疫反应和细胞因子活性显着富集，而KEGG结果显示趋化因子信号传导、Th1和Th2细胞分化、T细胞受体信号传导和血小板活化等关键通路显著富集,总的来说，这一系列分析发现了22个基因，这些基因不仅显示出在疾病中的表达显着改变，而且还显示出与组织病理学炎症的强烈关联。
为了研究这 22 个炎症相关基因的潜在相互作用，进行了 PPI 分析。这些基因的相互作用网络包含 13 个节点和 23 个边，然后将 PPI 网络数据导入 Cytoscape 软件以识别中心枢纽基因。Hub 基因是通过与六种 cytoHubba 算法（Closeness、Degree、EPC、MCC、MNC 和 Stress）的前 6 个基因相交来确定的。 GZMA、GZMK、CCL5和CXCL9的基因为枢纽基因，与对照组相比，这些基因在IPAH中显著上调（p < 0.05),此外，ROC曲线显示，这4个枢纽基因的AUC值较高，可作为IPAH的独立指标。总的来说，相互作用网络揭示了四个中心枢纽基因，这些基因可能在与IPAH相关的炎症反应中发挥关键作用。
随后，在MCT诱导的大鼠肺动脉高压模型中研究了这4个枢纽基因的表达。与对照组动物相比，MCT组表现出明显的肺血管重塑。此外，MCT组的右心室收缩压和右心室肥厚显著升高 （p < 0.05），证实了肺动脉高压的成功诱导。肺组织mRNA水平分析显示，与对照组相比，MCT组Gzma、Ccl5和Cxcl9显著上调（p < 0.05），而两组Gzmk表达无显著差异（p = 0.2293）。因此，GZMA、CCL5 和 CXCL9 被认为是后续研究与其作用相关的确切细胞类型的候选基因。
采用ScRNA-seq数据来揭示这三个候选基因的主要来源细胞和靶细胞类型。在排除低质量细胞后，鉴定出 25 个细胞簇，使用每个簇的TOP基因标记，将簇注释为12种细胞类型,每种细胞类型对标记基因的特异性表达证实了作者的细胞类型注释的可靠性。值得注意的是，GZMA 和 CCL5 在 T 细胞和自然杀伤 （NK） 细胞中表现出高表达水平 ，而CXCL9在所有细胞类型中均表现出低表达，因此后续分析主要集中在CCL5和GZMA上。作者分离出 CCL5 和 GZMA 表达水平大于零的 T 和 NK 细胞，揭示了 IPAH 患者这些细胞类型中 CCL5 表达显着增加，而GZMA在患者细胞和对照细胞之间没有差异。重要的是，iTALK分析显示，CCL3通过相同的受体介导T细胞和NK细胞与血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞的相互作用,虽然没有发现GZMA的相互作用受体。综上所述，scRNA-seq结果表明，CCL5是T细胞和NK细胞分泌的重要炎症因子，由于其对内皮细胞和平滑肌细胞的调节作用，可能与IPAH的血管重塑有关。
总结 综上所述，作者采用创新的方法整合组织病理学和转录组学数据，进行了全面的分析，揭示了CCL5作为T细胞和NK细胞产生的关键介质，参与了IPAH的血管炎症和重塑过程。这种新的分析框架可以通过将现有数据集转化为新的和易于处理的疾病治疗靶点来加速转化研究。
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