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肝纤维化是多种急性或慢性肝损伤的病理过程，当肝星状细胞（HSC）被激活时，细胞外基质（ECM）过度积累引起肝纤维化，针对HSC激活是一种有前途的治疗方法，抑制有氧糖酵解被报道可以抑制HSC活化并改善肝纤维化。梓醇（Catalpol，CAT）是地黄中发现的一种环烯醚萜苷，具有多种药理特性，包括抗氧化、抗炎、抗糖尿病和抗纤维化作用。然而，目前尚无关于CAT是否调节HSC中的有氧糖酵解以抑制肝纤维化的报道。 2024年9月13日，贵州医科大学赵雪珂团队在Phytomedicine上发表了题为“Catalpol ameliorates
liver fibrosis via inhibiting aerobic glycolysis by EphA2/FAK/Src signaling
pathway”的文章，发现CAT通过抑制活化的HSC有氧糖酵解，改善CCl4引起的肝损伤和肝纤维化。机制上，CAT靶向EphA2，下调其磷酸化水平，减少与FAK的结合，降低FAK/Src的磷酸化水平，从而抑制活化的HSC有氧糖酵解，改善肝纤维化。研究结果揭示CAT具有治疗肝纤维化的潜力，是通过EphA2/FAK/Src信号通路抑制活化的HSC的有氧糖酵解实现。
1、CAT改善CCl4诱导的小鼠肝损伤和炎症 为了研究CAT对体内肝损伤和炎症的影响，作者使用CCl4建立小鼠肝纤维化模型，发现经CAT治疗后，CCl4引起的小鼠肝脏病理变化得到改善，包括坏死和炎症细胞浸润，肝脏/体重比得到挽救，血清ALT、AST和ALP的水平，以及IL-6、IL-1β等炎症因子的升高得到逆转。结果表明CAT显著减轻了CCl4治疗小鼠的肝损伤和炎症（图1）。
图1 CAT改善CCl4诱导的小鼠肝损伤和炎症 2、CAT减轻CCl4诱导的小鼠的肝纤维化 CAT剂量依赖性地显著减少肝切片中胶原纤维的沉积量，IHC染色、WB、IF染色显示CAT降低α-SMA和Col-I的表达。结果表明CAT改善了CCl4诱导的肝纤维化（图2）。此外，体外EDU、划痕试验和transwell实验表明CAT抑制TGF-β激活的LX-2细胞的增殖、迁移和纤维化，并且这种作用被CAT以剂量依赖性方式抑制。
图2 CAT减轻CCl4诱导的小鼠的肝纤维化 3、CAT抑制体外和体内的有氧糖酵解 对CAT的靶标和与肝纤维化相关的基因进行交集，对交集的基因进行KEGG富集分析，发现有氧糖酵解的显著富集。同样，与正常对照组相比，肝纤维化患者的有氧糖酵解相关蛋白有所增加。进一步通过TGF-β激活的LX-2细胞以及CCl4诱导的小鼠发现体内和体外肝纤维化中与有氧糖酵解相关的标志物增加，但被CAT治疗有效抑制。这些发现表明CAT可缓解体内和体外的有氧糖酵解（图3）。
图3 CAT抑制体外和体内的有氧糖酵解 4、CAT 通过FAK/Src信号通路抑制肝纤维化中的有氧糖酵解 作者前期研究发现，FAK磷酸化水平的提高促进了HSC的有氧糖酵解，而抑制FAK（PF552271）可以抑制活化的HSC有氧糖酵解。同样，作者发现CAT治疗以剂量依赖性方式逆转TGF激活的LX-2细胞中FAK和Src的磷酸化水平的升高，降低Col-I和α-SMA，p-FAK/p-Src和有氧糖酵解相关蛋白的表达水平。FAK的过表达促进了TGF-β激活的LX-2中纤维化标志物、p-FAK/p-Src和有氧糖酵解相关蛋白的蛋白表达水平，这些影响可以通过CAT治疗部分逆转。结果证明CAT通过FAK/Src信号通路抑制肝纤维化中的有氧糖酵解（图4）。
图4 CAT通过FAK/Src信号通路抑制肝纤维化中的有氧糖酵解 5、TGF-β激活EphA2/FAK/Src通路促进LX-2细胞增殖、迁移和纤维化 通过对靶标预测数据库的分析，预测CAT的潜在靶基因，结果表明FAK不是CAT的潜在直接靶标。通过免疫沉淀结合质谱实验鉴定互作蛋白，将FAK相互作用蛋白数据集、CAT靶标和蛋白激酶数据集进行了整合分析，表明EphA2是CAT的直接靶标。然而，目前尚无关于EphA2对肝纤维化影响的报道。作者发现肝纤维化组的EphA2磷酸化（S897）水平升高。此外，EphA2的过表达促进了HSC的迁移，促进了Col-I和α-SMA、p-EphA2/p-FAK/p-Src及有氧糖酵解相关蛋白的蛋白水平，结果提示EphA2可能通过FAK/Src信号通路促进有氧糖酵解诱导的肝纤维化（图5）。
图5 TGF-β激活EphA2/FAK/Src通路促进LX-2细胞增殖、迁移和纤维化 6、CAT 直接靶向 EphA2，减少与 FAK 的结合 进一步作者通过CETSA实验验证CAT和EphA2之间存在直接相互作用，通过对接模拟确定了CAT与EphA2的结合模式，通过免疫共沉淀也表明TGF-β刺激了LX-2细胞中EphA2与FAK之间的相互作用，并在CAT处理后降低了它们的相互作用。结果表明CAT通过靶向EphA2来抑制FAK/Src磷酸化（图6）。
图6 CAT 直接靶向 EphA2，减少与 FAK 的结合 7、CAT 通过EphA2/FAK/Src通路抑制肝纤维化中的有氧糖酵解 接着，作者探究了CAT与EphA2结合是否影响EphA2的磷酸化和表达水平，发现肝纤维化中EphA2的磷酸化水平升高，然而在CAT治疗后这种趋势以剂量依赖性方式逆转。此外，CAT抑制了TGF-β激活的LX-2中迁移、纤维化标志物、EphA2/FAK/Src和有氧糖酵解相关蛋白的表达。CAT与CAT+ALW（EphA2 inhibitor）治疗效果的比较表明，联合治疗后，ALW单药疗效无进一步提高。这些研究结果表明，CAT的抗纤维化作用源于抑制EphA2/FAK/Src信号通路介导的有氧糖酵解（图7）。
图7 CAT体外通过EphA2/FAK/Src通路抑制肝纤维化中的有氧糖酵解 为了进一步证明CAT的抗纤维化作用是由EphA2介导的有氧糖酵解引起，用ALW或 ALW+CAT治疗CCl4治疗的小鼠。同样，结果表明ALW显著减轻了CCl4治疗小鼠的肝纤维化并抑制有氧糖酵解水平。然而，ALW+CAT并没有进一步改善纤维化和有氧糖酵解。结果表明CAT通过EphA2/FAK/Src通路抑制有氧糖酵解（图8）。
图8 CAT体内通过EphA2/FAK/Src通路抑制肝纤维化中的有氧糖酵解 总结 研究表明，EphA2与小鼠模型中的肝纤维化有关，CAT可用于治疗肝纤维化。机制上，在CCl4诱导的小鼠和TGF刺激的HSC中，CAT治疗显著降低了HSC的活化和胶原沉积。通过改善EphA2/FAK/Src信号传导，CAT抑制了有氧糖酵解反应，从而阻断了HSC的活化并改善了肝纤维化（图9）。因此，CAT可以被视为一种有前途的肝纤维化治疗策略。
图9 地黄活性成分梓醇靶向EphA2抑制有氧糖酵解改善肝纤维化 |
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