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目：LcASR enhances tolerance to abiotic stress in Leymus chinensis and Arabidopsis thaliana by improving photosynthetic performance 刊名：Plant Journal 作者：Wei Chi, Daili Ji et al. 单位：Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 日期：18 November 2024    01 摘要  02 技术路线  A. thaliana (Columbia, flu) and L. chinensis Phylogenetic analysis、 RNA sequencing, Q-PCR, and 3D structural modeling of LcASR and FLU、Photosynthetic parameter measurements Plasmid construction and plant transformation Physiological indicator measurements Analysis of intermediates of TBS CoIP assays、BN-PAGE, SDS-PAGE, and immunoblotting Analysis of intermediates of TBS 03 主要结果 3.1 LcASR基因的鉴定 为了鉴定羊草中新的叶绿素代谢调节因子，我们比较了在黑暗中发芽的5天龄幼苗和10小时后转移到正常光照下的幼苗之间的转录组变化。在从黑暗到光照条件下表达显著增加的转录本中，我们发现了一种编码具有光合生物中常见的保守结构域的新蛋白质的转录本，包括跨膜结构、卷曲线圈结构域和三个C末端四肽重复（TPR）结构域。该蛋白被命名为LcASR（羊草非生物胁迫抗性）。 LcASR蛋白与拟南芥的FLU具有70%的序列同一性，与水稻具有81%的序列同一致性，与小麦的FLU有96%的序列同一起。基于这些发现，我们假设LcASR可能是羊草中FLU的功能等价物。生物信息学分析表明，LcASR蛋白有一个60个氨基酸的前导肽作为叶绿体的靶向信号。 为了确认LcASR的亚细胞定位，从拟南芥叶片分离的原生质体中瞬时表达了LcASR-GFP融合蛋白。GFP信号与叶绿体自动荧光完全融合，验证了LcASR-GFP融合蛋白对叶绿体的特异性靶向性。 为了研究LcASR在拟南芥中是否与FLU具有相同的作用，在35S-CaMV启动子的控制下，在u和WT背景下产生了在其C末端表达FLAG标记的LcASR的转基因幼苗，并将其命名为LcASR互补（LcASRcom）系或LcASR（HO）系的异源过表达。对HO和LcASRcom T1代系的幼苗进行了FLAG含量测试。选择两HO系（分别命名为HO4、HO14）和表现出强烈FLAG信号的LcASRcom进行进一步研究。当暴露于暗/光循环条件下，这四种植物表现出漂白表型，与之前的研究一致。值得注意的是，LcASR在u中的表达并没有完全恢复光漂白表型，表明LcASR并没有在体内功能上取代FLU。这一结果表明，与FLU相比，LcASR在拟南芥中起着独特的作用。 3.2 通过异源LcASR表达增强拟南芥的强光反应 为了进一步验证LcASR是否与FLU共享叶绿素合成调控功能，我们测量了HO拟南芥品系的鲜重和干重、叶绿素含量和光合性能。先前的研究表明，FLUOE品系在中等光照和低光照条件下生长时，叶绿素含量显著降低。相反，与野生型相比，我们的HO幼苗没有显示出明显的变化。生长模式和叶绿素含量都没有改变，这进一步证明了LcASR与拟南芥FLU相比具有不同的功能。 为了评估光强度是否会影响HO线的性能，我们分析了非光化学猝灭（NPQ）的光响应曲线、PSII的电子输运速率（ETR）、非调节能量耗散的量子产率Y（NO）和有效量子产额Y（II）。HO品系和野生型之间的Y（II）、慢诱导曲线和ETR具有可比性，与它们的未分化表型一致。然而，随着光照强度的增加，HO系的NPQ和Y（NPQ）显著低于WT植物，表明HO系的散热效率提高。HO管线中Y（NO）的上升进一步支持了这一趋势，这表明能量耗散不受控制。这些结果表明，在光强增加的情况下，HO系的光保护反应比WT更有效。 3.3 通过拟南芥中LcASR的异源表达增强高耐光性 为了进一步探索HO系的高光响应是否会导致高耐光性，将适应生长光的离体幼苗叶片转移到HL条件下6小时以诱导光抑制。野生型和HO系的Fv/Fm比值随着长时间的强光处理而逐渐降低。然而，野生型植物的下降比HO系明显得多（图1a，b）。这一结果表明HO线的光损伤率较低或修复率较高。为了确定LcASR是否参与光损伤或修复过程，我们通过评估拟南芥叶片从强光转移到弱光后PSII活性的恢复来监测PSII修复过程。经过5小时的恢复期后，除WT系外，所有HO组的Fv/Fm比值均达到0.75，表明WT系的恢复效果较差。因此，与野生型叶片相比，LcASR过表达系从光抑制中恢复得更好（图1b）。这些结果表明，拟南芥中LcASR的过量产生通过有效的修复提高了对强光的耐受性。 3.4 拟南芥中LcASR的过表达有助于在强光下稳定PSII复合物 为了探索HO品系抗强光的分子机制，我们检测了HL处理前后叶绿素含量。在暴露于HL 6小时后，HO系和WT植物的叶绿素含量都有类似的下降（图1c）。这一发现表明，在连续HL条件下，过量LcASR对叶绿素积累没有明显影响。然而，在修复过程中，HO14品系的叶绿素含量略高，这意味着色素合成在修复过程中将发挥作用。 为了进一步阐明HO品系耐光性高的原因，我们研究了正常光和高光条件下光系统复合体的状态（图1d）。如前所述，通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分离WT和HO系的类囊体。当在正常光照下生长时，每种复合物和中间体的含量与野生型植物相当。然而，当这些植物在中等光照下生长时，WT中PSII超复合物和LHCII三聚体的水平比HO植物显著降低（图1d，约低20-30%）。此外，两条线中较低重量复合物（如PSII二聚体和单体）的量相当（图1d）。HO系中PSII超复合物和LHCII三聚体的相对较高含量强烈表明，过量的LcASR有助于在更高的光胁迫下稳定这些复合物。 为了进一步辨别在中等光生长下哪个亚基过度积累，BN-PAGE解析的复合物随后在第二维度上被分离成它们的亚基（图1e）。正如预期的那样，除了在生长光条件下HO和WT植物之间的LHCII相关复合物外，PSII亚基的数量没有显著差异（图1e）。在中等光照条件下，PSII超复合物和二聚体中D1、D2、CP43和CP47蛋白的量在两组之间显示出无法检测到的差异。然而，发现LHCII蛋白在HO系的几乎所有相关成分中都明显过度积累（图1e）。在高光条件下，LHCII与PSII复合物的各种中间体的持续结合强烈表明，拟南芥中LcASR的过表达提高了叶绿体中LHCII和PSII复合物质的亲和力。
3.5 LcASR的异源表达提高了碳同化效率 光依赖性反应为碳同化提供了减少的功率和能量，为了检查LcASR异源表达是否影响碳同化，我们测量了气孔导度（Gs）、净光合速率（Pn）、蒸腾速率和细胞间CO2浓度（Ci）。我们观察到，随着光强度从100到300 的增加，Pn增加，随后在高光条件下，Pn降低，这表明光抑制。即使在强光胁迫下，HO谱线在所有光照强度下的Pn也明显高于WT。而蒸腾速率、细胞间CO2浓度和Gs在不同程度上低于野生型。细胞间CO2含量不仅是碳固定的底物，而且通过ROS形成的反馈调节来纠正光损伤。这些结果支持LcASR过表达对碳同化的积极调节作用，碳同化将储存更多的有机产物或能量以抵抗压力。 3.6 LcASR促进黄化拟南芥幼苗的转绿 为了阐明LcASR增强拟南芥光合效率的机制，我们假设叶绿素调节可能在光保护中发挥作用。鉴于LcASR与FLU共享TPR结构域，FLU在光形态形成过程中抑制ALA合成，我们最初的重点是研究WT和HO品系黄化幼苗绿化过程中的叶绿素合成。Pchlide是叶绿素生物合成的中间前体。HO品系中的PChlide荧光与野生型相似，与高PChlide水平的u有很大不同（图2a）。77K荧光光谱显示，与WT相比，HO系具有等量的游离与结合PChlide，这与它们的PChlide荧光一致（图2b，c）。这些发现表明，过量的LcASR不会影响绿化过程中Pchlide含量水平的调节。将6天大的黄化拟南芥幼苗进一步暴露在恒定光照下24小时，HO4系显示出比WT更深的绿色（图2d）。 对HO4中叶绿素含量的进一步分析表明，与野生型相比，HO4中的叶绿素含量显著增加，这与视觉观察结果一致（图2e）。相反，HO14的叶绿素含量与野生型相当，可能反映了LcASR表达水平的差异。在光照后，90%以上的野生型和HO幼苗显示出开放的绿子叶，但u幼苗除外（图2f）。因此，HO品系在绿化阶段表现出叶绿素合成的增强。我们对在黑暗和光照（24小时）后生长的各种转基因系中的四吡咯生物合成（TBS）中间体进行了更深入的分析。与在黑暗中孵育的野生型幼苗相比，两个HO系的TBS中间体含量没有显著变化（图2g）。然而，在光照24小时后，HO线中检测到更高水平的ALA（图2h）。因此，我们可以得出结论，在光照条件下，LcASR的过度表达往往会影响叶绿素合成的早期步骤。假设叶绿素代谢的协调基因表达可以在不同量的底物下进行。我们进一步量化了叶绿素合成中间酶PPO1、PPO2和CHLH/D/I的转录水平，以确定它们是否对应于绿化过程中HO系叶绿素含量的增加。PPO1、PPO2、CHLH/D/I转录物的积累水平高于野生型植物（图2i）。因此，我们提出上调的反应酶可能是HO幼苗出现深绿色的原因，并参与了光照条件下叶绿素合成的调节。
3.7 LcASR通过直接与叶绿素合成酶相互作用优化叶绿素合成 根据我们的研究结果，在HO品系中检测到ALA的积累和相应增加的PPO1、PPO2、CHLH/D/I转录本（图2i），这些转录本负责黄化幼苗绿化过程中叶绿素的增强，但与成熟叶片中的叶绿素含量不符。GluTR、GBP（GluTR投标蛋白）、CHL27、PORB、PORC和CHLI1/2在叶绿素合成的调节中与FLU发生物理相互作用。因此，我们怀疑含有相似TPR结构域的LcASR是否可以与参与叶绿素合成的这些酶相互作用。 使用双分子荧光互补（BiFC）测定，我们发现叶绿体中强烈而均匀的YFP信号揭示了LcASR nEYFP与AtPORB、AtPORC或AtCHLI1/CHL2-cEYFP之间的相互作用，而当AtCHL27与LcASR nEYFP共表达时，检测到弱荧光，与GluTR和GBP没有相互作用，如图3（a）和图S5所示。为了确认BIFC实验中检测到的相互作用，我们在中等光处理前后使用HO系的总蛋白进行了共免疫沉淀（CoIP）。如BIFC结果所示，LcASR和AtPORB、AtPORC、AtCHLI1和CHL27之间显示了类似的相互作用，而在中等光处理前后，AtPORB的相对CoIP信号量没有明显差异（图3b）。这些数据表明，LcASR可能在叶绿素合成的后期与酶发生生理相互作用，以在光照条件下保持其活性。 SWISS-MODEL和AlphaFold都是广泛用于蛋白质结构预测的先进计算工具，分别利用不同的方法——基于模板的建模和基于深度学习的方法。它们分别用于预测LcASR和FLU的结构。根据互补结果，我们发现AlphaFold和PyMOL预测的LcASR的假定三维结构不能与FLU完全重叠（图3c-g），尽管这两种蛋白质在卷曲和TPR区域表现出惊人的相似性。值得注意的是，主要区别在于N-末端环区。此外，SWISSMODEL揭示，FLU的TPR结构域完全位于基质中，而LcASR的TPR粘附在膜上，这可能会影响其与GluTR的相互作用，如我们的BIFC结果所示。LcASR和FLU之间推定结构的差异支持植物TPR蛋白的功能多样性。
3.8 LcASR在拟南芥中的异源表达增强抗旱性 干旱是限制陆生植物生长的主要压力。然而，研究表明，光合效率的提高可以大大减轻干旱胁迫的负面影响。同时，随着光照强度的增加，HO植物的气孔导度和蒸腾速率低于野生型，表明HO植物可能通过降低气孔开度来减少水分损失。这一观察结果使我们进一步推测HO品系是否通过调节气孔状态而具有抗旱性。经过一周的干旱处理，然后在充分灌溉的情况下恢复3天，我们发现HO系中的大多数植物表现出更好的恢复，各系的存活率在81.25%至93.75%之间。相比之下，野生型植物的中等存活率为43.75%。这些发现表明，LcASR过表达可以在轻度干旱胁迫下存活拟南芥幼苗。对叶片含水量和失水率的进一步测量支持了这一假设，因为HO植物的含水量更高，失水率更低。此外，HO植物中较高的叶绿素含量与图S6（a）中观察到的表型一致，进一步支持了光合性能的改善可能抵消干旱造成的损害的观点。干旱胁迫反应中的主要植物激素信号是脱落酸（ABA），它将诱导气孔关闭和其他干旱胁迫适应调节。 为了进一步阐明LcASR过表达对抗旱性的影响，研究了ABA信号基因KIN、AREB1A、众所周知的胁迫反应基因RAD22、RAD29A、RAD29B的表达模式，以及参与气孔运动的基因，包括内向和外向整流振荡样钾通道KAT1、SKOR、GORK的表达模式。我们的结果显示，与野生型相比，HO系中KIN、RD22、RAD29A和RAD29B的表达上调。值得注意的是，内向通道KAT1显著下调，而外向通道SKOR和GORK基因显著上调。因此，在LcASR-HO品系中，ABA途径可能在调节保卫细胞气孔开度方面发挥作用，从而调节水分流失，增强抗旱性。虽然这些观察结果肯定是有说服力的，但我们对抗旱性和LcASR本身之间的直接联系持谨慎态度，因为它可能是光合活性增强带来的辅助效益。 3.9 LcASR在羊草中的过表达增加了生物量 拟南芥中LcASR的表达增加了其耐光性和耐旱性，这促使我们进一步研究其在羊草中的作用。Dicots是农杆菌的天然宿主，像羊草这样的禾本科植物不耐农杆菌介导的转化，这阻碍了绵羊草的育种和基因功能的阐明。利用具有高效愈伤组织诱导和芽再生效率的品种Lc6-5，优化培养基，建立了一个成功的农杆菌介导的羊草转化系统。利用该系统将LcASR Flag构建体引入羊草，并选择了两条Flag水平明显升高的品系OE37和OE44进行进一步研究（图4a-c）。与拟南芥中的表达相反，OE系呈现深绿色，叶绿素含量分别比野生型高36%和57%（图4d，e）。此外，OE37和OE44品系的叶片分别宽了40%和20%，这导致单分蘖的鲜重和干重平均增加了20%至30%（图4f-h）。然而，生物量的增加并没有导致淀粉、可溶性糖或蛋白质含量的预期增加。据推测，在某些情况下，延迟衰老可以提高作物的产量表现。宏观上观察到的叶片衰老表现为叶片变黄，这表明从营养同化到营养再动员的代谢转变。在温室条件下生长6个月后，OE37和OE44品系与野生型相比表现出保持绿色的表型（图4i），这可能有助于其在生长季结束时获得更高的生物量积累。
3.10 LcASR提高了羊草的光合性能 生物量的增加是饲料的一个非常有价值的农艺性状。为了研究这一结果是否归因于光合性能的提高，我们评估了叶绿素荧光诱导和光响应曲线（图5a-f）。OE37和OE44植物显示出更高的Y（II）、ETR和Y（NO），表明在光强增加的情况下光合效率提高。与这些发现一致，当光吸收超过转换时，NPQ和Y（NPQ）的降低表明散热效率提高（图5a-f）。 为了确定LcASR是否可以像其在拟南芥中的作用一样提高羊草的耐光性，使用WT和OE系的离体叶片进行了光抑制和恢复实验。野生型的Fv/Fm比值下降比OE37和OE44系明显得多，表明光损伤更严重（图5g）。 为了进一步证实这一观点，我们根据将叶子转移到低光照后PSII活性的恢复来监测PSII修复过程。经过5小时的恢复期后，野生型的Fv/Fm比值达到0.7，而OE 37系的Fv/Fc比值为0.74。尽管OE44的回收率与WT线相似，但OE线似乎比WT具有更少的光抑制或更好的回收率（图5g，h）。与图1（c）所示的HL处理前后拟南芥WT和HO系中相似的叶绿素含量相反，我们观察到所有光强度变量组中OE37和OE44系的叶绿素水平显著升高（图5i）。
此外，我们还检测到HL处理（500和1500 lmol m 2 sec 1）后净光合速率（Pn）增加，蒸腾速率增加，气孔导度增强，所有这些都支持OE系光合性能的增强（图6a-d）。根据这些结果，我们推测OE37和OE44系较高的光合能力可能源于其较高的叶绿素合成效率。因此，我们对暴露24小时前后在黑暗中生长的OE系中的TBS中间体进行了分析。值得注意的是，在光照24小时后，OE37和OE44品系中检测到更高水平的Mg-Proto、Proto-IX、PChlide（图6e）。然而，与在黑暗中的野生型幼苗相比，OE系的Mg-Proto、Proto-IX、PChlide中间体含量显著降低，而Chlide含量显著升高（图6f）。值得一提的是，在光照条件下，OE品系的ALA水平高于野生型，这与我们在拟南芥中的结果一致。因此，我们可以推断，在光照条件下，LcASR的过度表达往往会影响拟南芥和羊草的叶绿素合成。
3.11 LcASR在强光下参与稳定羊草光合复合物 叶绿素分子通常与光系统蛋白结合形成复合物。OE37和OE44品系中色素水平的增加是否会导致光系统蛋白质和复合物含量的整体增加？为了研究这一点，我们使用免疫印迹来比较WT和OE植物在强光处理前后每个光系统中核心蛋白的水平（图7a-c）。我们的发现表明，在HL暴露后，OE系的D1、D2、CP43、Cytb6和LHCII水平比WT中观察到的水平高出至少20%。相比之下，PSI和ATP合酶的水平没有发生显著变化。有趣的是，我们发现在HL条件下，OE系的RbcL比WT增加了约10%，这与它们增强的生物量积累相一致。强光下光系统蛋白质含量的增加表明在这种条件下光系统复合物的结构稳定性和有效维护。为了验证这一点，我们使用BN-PAGE和二维（2D）分离来检查WT和OE系在强光处理前后光系统复合体的状态。结果表明，在正常光照条件下，OE谱线的超复合物丰度略高于WT（图7d）。通常，如Ji等人（2023）所报道，HL处理会导致拟南芥中光系统复合体的破坏和游离蛋白质的增加。然而，BN和2D分析都表明，在强光处理后，OE系仍然能够保持超复合物的稳定性，LHCII与光系统复合物结合牢固。相比之下，WT中超复合物的含量显著降低（图7d，e）。这一结果与我们在拟南芥中的发现一致，充分证明了LcASR在调节植物对强光的适应方面的普遍性（图1和图7）。
3.12 LcASR在羊草中的过表达对抗旱性没有影响 由于LcASR在拟南芥中的异源表达有效地增强了植物的抗旱性，我们在羊草中进一步验证了这一功能。对OE植物和野生型植物进行14天的干旱处理后，两组之间没有观察到显著差异。此外，对叶片失水率、叶片含水量的进一步测试显示，除叶绿素含量外，没有显著差异。因此，LcASR在羊草中的过表达并没有像在拟南芥中观察到的那样赋予抗旱性。 04 结论  我们推测，LcASR具有微调叶绿素含量的能力，从而稳定LHCII与光系统复合物的结合，最终在胁迫条件下稳定光合作用。这一特性对于羊草在割草和放牧后的恢复至关重要，因为茂密的叶子覆盖的丧失使草更容易受到光抑制。此外，我们观察到，在秋季，羊草的过表达系表现出稳定的绿色表型。这可以延长放牧期，延长生长季节，提高饲料产量。LcASR的功能可以为羊草乃至作物育种提供宝贵的遗传资源。 05 原文获取 原文链接： https://onlinelibrary./doi/10.1111/tpj.17144 获取原文(文末附件）： https://www./h-nd-357.html END 06 广告 |
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