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利用Bulk-RNA测序数据鉴定LUAD中与PCD相关的m6 A基因为了阐明LUAD中m6 A相关PCD的参与，分析了癌组织和正常肺组织中23个m6 A调控基因的表达谱。研究结果显示，11个调控基因，包括3个“写入者”和8个“读取者”（胃L3、RBM 15、VIRMA、ELAVL 1、YTHDF 1、YTHDF 2、LRPPRC、IGF 2BP 1、IGF 2BP 3、HNRNPC、HNRNPA 2B 1），在LUAD中显著上调，而2个“擦除者”和3个“写入者”（FTO、ALKBH 5、WTAP、ZC 3 H13、胃L14）显示下调。通过考克斯回归和Kaplan-Meier生存分析，使用TCGA数据集的四种生存结局（无病间期、疾病特异性生存期[DSS]、OS和无进展间期）评价这些调节因子的预后意义。分析显示，大多数调节因子作为风险因素，ELAVL 1与所有四种生存结局显著相关。此外，通过斯皮尔曼相关性分析检查了这些m6 A因子之间的相互作用，表明表达模式高度相关。这些结果突出了m6 A因子之间复杂的相互作用。随后，从TCGA-LUAD队列中提取与m6 A和PCD相关的基因的表达矩阵，然后进行相关性分析。与PCD相关的基因与至少一个m6 A基因显著相关（|R|> 0.3和p < 0.05）被分类为m6 A相关PCD基因，导致鉴定出1054个这样的基因（图1A）。在合并来自正常TCGA样品的表达数据并应用标准后，|log 2 FC（2个FC的对数）|> 0.5且p < 0.05时，确定了341个差异表达的基因（图1B）。通过进一步的考克斯回归和Kaplan-Meier生存分析，发现146个m6 A相关的PCD基因与LUAD患者的OS显著相关。选择这些基因作为m6 A相关PCD基因集用于进一步研究。使用单细胞测序数据鉴定LUAD患者中涉及PCD的关键m6A相关基因该研究首先对LUAD单细胞测序数据集GSE 171145进行降维和聚类分析，该数据集包含9个样本。该过程导致鉴定出14个不同的细胞亚型。之后，使用特征标记物注释这些亚型，其允许鉴定各种细胞类型，例如NK/T细胞、B细胞、浆细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肥大细胞、骨髓细胞、循环细胞、粒细胞和内皮细胞。在注释细胞类型后，使用AUCell、UCell、singscore、ssgsea和AddModuleScore等方法，利用m6 A相关PCD基因集评价每个细胞内的m6 A相关PCD活性（mPCD活性）。结果表明，循环和骨髓细胞表现出增加的mPCD活性，而B细胞和NK/T细胞表现出较低水平的活性（图1C、D）。随后基于中值活性评分将细胞分为高mPCD组和低mPCD组，并鉴定这两组之间的差异表达基因以进一步研究具有不同mPCD活性水平的细胞之间的内在关系。细胞-细胞通讯分析显示，高mPCD组中相互作用的数量和强度均显著大于低mPCD组，成纤维细胞和内皮细胞显示出特别突出的通讯模式。此外，还注意到组间通路活化的差异。最后，进行斯皮尔曼相关性分析以鉴定与mPCD活性评分相关的前150个基因（图1E）。这些基因与先前鉴定的差异表达基因交叉引用，并被认为是通过单细胞测序分析确定的关键基因。首先，去除TCGA和GEO数据集的批次效应（图2A），处理后的数据组成如图2B所示。然后对单细胞测序发现的关键基因进行Kaplan-Meier生存分析和单因素考克斯回归分析，进行初步筛选。该过程鉴定了具有43个基因的预后基因集，包括31个风险因子和12个保护因子（图2C）。为了创建与mPCD相关的预后特征，使用10种机器学习算法的组合进行了广泛的分析。CoxBoost + SuperPC方法在六个验证组中具有最高的平均C指数，使其成为进一步研究的优选模型（图2D）。为了评价mPCDS的临床意义，针对年龄、性别、EGFR状态、p53状态、分期和T分期等几个临床因素，在7个队列中测试了其性能。与其他临床因素相比，mPCDS始终显示出更高的C指数（图3A）。通过检查每个基因在预后特征中的系数并将其与先前发表的LUAD预后特征进行比较，发现mPCDS在所有研究的队列中表现一致，包括TCGA、GSE 11969、GSE 13213、GSE 26939、GSE 29016、GSE 31210和GSE 72094（图3B）。根据中位数得出的mPCDS风险评分用于将患者分为高风险和低风险类别。在TCGA训练集和其他验证集中，高风险患者的OS显著低于低风险患者。为七个队列生成的PCA图进一步表明，mPCDS有效地将患者分为两个不同的组，凸显了其预测结果的能力。此外，时间依赖性AUC分析表明，mPCDS在多个独立组中始终显示出较强的预测能力。模型中mPCDS评分与13个关键基因表达的相关性，除了与mPCDS呈负相关的SFTPB和CLIC 6外，其余基因均呈正相关。对这些模型基因的进一步分析显示，具有SLC2A1、HSPD 1、HMGA 1、KRT 8、KRT 18、ALDOA、RCN 1、PPIA、TXN、KRT 7和LAMC 2的高表达的患者具有较低的OS，而具有SFTPB和CLIC 6的高表达的患者具有较好的结果，鉴定SFTPB和CLIC 6为保护性基因。在图4A中，显示了高风险组和低风险组之间的TMB、突变频率和突变模式的差异。TP53、TTN、MUC16、CSMD 3和ZFHX 4基因被鉴定为具有最高突变率。据观察，与低mPCDS组相比，高mPCDS组的TMB显著增加（图4B），mPCDS评分与TMB之间呈正相关（图4C）。生存分析表明，高TMB组中的患者具有更好的生存结果，而低TMB组中的患者表现出明显更差的预后（图4D）。此外，当将TMB与风险评分相结合时，在低TMB +高mPCDS组中发现最低的存活率，而在高TMB +低mPCDS组中注意到最佳存活率（图4E）。这些发现强调了TMB和风险评分之间的相互作用，影响LUAD患者的预后。使用mPCDS作为TMB的补充，可以对患者结局进行更详细的分层，强调整合两种指标对LUAD预后评估的重要性。 由于mPCDS对LUAD预后具有较强的预测能力，因此对潜在机制进行了进一步研究。GSVA用于测量LUAD患者中各种生物学途径的激活水平。创建热图以显示mPCDS评分、致癌途径和抗肿瘤免疫途径之间的复杂关系（图5A）。发现mPCDS评分与大多数致癌途径显著正相关。在癌症免疫周期的七个阶段中，确定了mPCDS评分与第1阶段（癌抗原释放）、第4阶段（免疫细胞募集）和第7阶段（癌细胞杀伤）之间的显著相关性。此外，富集分析（图5B）表明，具有高mPCDS评分的组群在关键途径中显著富集，包括Croonquist IL6去磷酸化、端粒蛋白定位的建立、蛋白酶体调节颗粒、DNA复制起始、有丝分裂DNA复制、蛋白酶体辅助复合物、E2F靶标、MYC靶标和G2M检查点。这些途径在高mPCDS组中的显著富集表明了一个复杂的分子改变网络，该网络驱动LUAD中的肿瘤侵袭性。炎症、端粒维持、蛋白质降解、DNA复制、细胞周期调节和癌基因激活等关键过程都涉及到。这些发现为管理高风险LUAD患者的潜在治疗靶点和生物标志物提供了实质性见解。如图5C所示，进一步分析显示高mPCDS组和低mPCDS组之间的致癌和免疫相关途径存在显著差异。具体而言，诸如克罗斯比E2 F4靶点、蛋白质定位于端粒的建立的正调控、有丝分裂胞质分裂的正调控、反应组G2 M DNA复制检查点、DNA复制前起始复合物、外动粒、DNA引发酶活性的调控和Reactome 1磷酸化的途径在高mPCDS队列中显著更丰富。这些结果强调了mPCDS在描绘LUAD的分子和免疫景观方面的预后和生物学意义。高mPCDS组中致癌和免疫途径之间错综复杂的相互作用突出了导致肿瘤进展和免疫逃避的复杂分子变化。这些途径的识别为开发靶向治疗和加强高危LUAD患者的预后评估奠定了基础。 由于在mPCDS和某些炎症和免疫相关信号之间观察到的显著关联，对mPCDS和TME之间的联系进行了全面探索。最初评价了高和低mPCDS组中的免疫调节剂水平（图6A）。结果发现，虽然75个免疫调节基因中的大多数在两组中表现出相似的表达，但高mPCDS组的突变率更高，包括扩增和缺失。这表明，尽管免疫调节因子表达没有显著差异，但高mPCDS组的遗传不稳定性可能损害这些基因的功能和调节，导致免疫调节和有效性受损，这可能导致免疫应答效率降低和预后不良。CD 274（PD-L1）、PDCD 1（PD-1）、PDCD 1 LG 2（PD-L2）和LAG 3等基因是ICI的中心靶点，在高mPCDS组中显示突变率增加，表明对检查点抑制剂治疗的反应可能存在差异。突变和表达的变化可能会改变这些肿瘤如何与靶向这些检查点的治疗性抗体相互作用。发现对T细胞活化至关重要的CD 80和CD 40在高mPCDS组中发生突变，这可能阻碍T细胞的适当活化并导致免疫应答减弱。干扰素-γ、IL 12 A和CCL 5参与免疫细胞的募集和活化，它们在TME内的功能可能由于这些突变或调控变化而被破坏。为了更好地理解免疫细胞浸润，使用六种不同的方法来评估免疫浸润并量化高mPCDS组和低mPCDS组之间的差异（图6 B）。结果一致显示，免疫细胞，包括B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，在低mPCDS组中更普遍。这表明免疫监视在这组中更活跃和有效。这些免疫细胞对于识别和消除肿瘤细胞至关重要，而在高mPCDS组中，由于遗传不稳定性和关键调控基因的突变，免疫反应可能会受到影响。相关性分析证实了这些发现，其中mPCDS显示与基质、免疫和估计评分负相关，而与肿瘤纯度正相关（图6C）。 为了评价mPCDS在预测免疫治疗结局中的作用，检查了具有可用免疫治疗数据的队列。在OAK队列中，比较了高mPCDS组和低mPCDS组患者在6个月和12个月时的有限平均生存时间，沿着治疗后3个月观察到的长期生存差异。这显示了免疫疗法的延迟临床效果（p< 0.05;图7A，B）。值得注意的是，低mPCDS组的患者生存率更高，这表明他们从免疫治疗中获益更多。在GSE 91061队列中发现了类似的结果，其中Kaplan-Meier分析表明较低的mPCDS评分与免疫治疗后改善的结果相关（图7 C）。为了进一步研究高mPCDS组和低mPCDS组之间对免疫治疗的不同应答，对接受治疗的黑色素瘤队列进行了亚组定位。发现较低的mPCDS评分与对PD-1治疗的较好应答相关（图7 D）。此外，使用TIDE算法和LUAD转录组数据分析免疫浸润和免疫治疗应答之间的关系（图7 E）。观察到两组之间对免疫疗法的应答率存在显著差异。根据TIDE结果，LUAD中mPCDS评分较低的患者可能对免疫治疗有更好的反应。在GSE 91061队列中也观察到类似的结果（图7 H）。这些发现强调了mPCDS评分不仅有助于预测预后，而且有助于预测免疫治疗的阳性反应，使mPCDS成为指导治疗决策和为LUAD患者定制治疗的重要工具。有趣的是，尽管在高mPCDS组中观察到更高的PD-L1表达水平（图7 G），这通常与对ICI的更好反应有关，但作者的结果表明，单独的PD-L1表达可能不足以预测免疫治疗的有效性。尽管PD-L1水平升高，但mPCDS评分较高的患者预后较差，对ICI的反应较弱。 为了探索mPCDS和药物敏感性之间的联系，使用CTRP和PRISM数据库中大型癌细胞系（CCL）集合的药物敏感性和基因表达数据来创建药物反应预测模型。通过研究基因表达谱，使用“pRRophetic”软件包中的岭回归模型计算临床样品中每种化合物的AUC值，AUC值越低表明药物敏感性越高。首先使用以下阈值分析高mPCDS组和低mPCDS组之间的药物应答差异：|log2 FC（2个FC的对数）|> 0.20以找到AUC值差异最显著的化合物。然后，使用斯皮尔曼相关性计算AUC值和mPCDS评分之间的相关性，重点是具有相关系数的化合物|R|在CTRP和PRISM数据集中> 0.20。鉴定了来自CTRP数据集的两种化合物和来自PRISM数据集的三种化合物（图7F）。发现所有确定的药物的AUC值和mPCDS评分之间呈负相关，表明它们可能对高mPCDS组的患者更有效。箱形图进一步显示，高mPCDS组中的患者对紫杉醇、吉西他滨、达沙替尼和5-氟尿嘧啶等药物的敏感性增加（图7I-L）。为了评估mPCDS在各种癌症中的有效性，使用了TCGA PanCanAtlas数据集。计算来自32种不同癌症的样品的mPCDS评分，并可视化这些风险评分的分布（图8A，B）。进行了考克斯回归分析，以确定mPCDS是否影响不同癌症的OS、DSS和无进展生存期（PFS）。研究发现，在32种癌症类型中的17种中，mPCDS对OS、DSS和PFS产生了负面影响，这表明mPCDS模型可能是多种癌症类型不良结局的广泛适用的预后指标。有趣的是，mPCDS对宫颈癌（CESC）、胃癌（STAD）、睾丸生殖细胞肿瘤、肾嫌色细胞、肾上腺皮质癌和前列腺癌（PRAD）等癌症表现出一致的保护作用。这些结果表明，在这些癌症中发挥作用的保护机制应进一步研究。然后应用基因集富集分析（GSEA）来检查高和低mPCDS组之间肿瘤标志基因集的差异（图8D）。在高mPCDS组中，诸如肿瘤坏死因子α（TNFA）信号传导（通过核因子κ B（NF KB））、kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）信号传导和上皮-间充质转化等途径富集。这些途径为这些肿瘤中观察到的侵袭性特征提供了分子基础，这些侵袭性特征促进细胞增殖、存活和转移，所有这些都导致较差的临床结果。靶向这些通路可能会改善mPCDS评分高的患者的结局。需要更多的研究来证实这些发现，并探索降低高危肿瘤侵袭性的可能疗法。还通过分析模型基因在各种癌症中的表达来检查模型基因在泛癌症背景中的作用（图8 E）。大多数模型基因在几种癌症类型中表现出高表达水平，表明它们参与了肿瘤的发展和进展。另一方面，SFTPB、LAMC 2、KRT 7和CLIC 6等基因的表达模式在不同癌症类型之间差异显著，表明这些基因可能发挥环境依赖性作用。此外，分析了模型基因的甲基化水平（图8 F），显示大多数模型基因在肿瘤中具有降低的甲基化，这可能导致它们的过表达并有助于肿瘤发展。使用考克斯建模和Kaplan-Meier存活分析对核心基因RCN 1在泛癌症背景下的预后能力进行进一步研究（图8 C）。热图显示，RCN 1是大多数癌症的危险因素。这项研究强调了mPCDS在各种癌症类型中的重要性，并强调了进一步研究其他癌症类型的领域。 作者的研究结果表明，RCN 1表达升高与LUAD患者的预后不良有关，表明RCN 1是肿瘤的危险因素。然而，RCN 1驱动肺癌进展的具体机制仍不完全清楚。为了检查RCN 1蛋白水平，对六对LUAD肿瘤组织和相邻正常组织进行蛋白质印迹（图9A）和免疫组织化学（IHC）染色（图9B）分析。与正常组织相比，RCN 1在肿瘤组织中的表达显著更高，这表明RCN 1可能在肺癌中起癌基因的作用。为了进一步研究RCN 1的作用，采用siRNA介导的敲低来降低A549和PC9细胞系中的RCN 1 RNA水平（图9C）。结果显示，RCN 1敲低显著降低LUAD细胞的增殖（图9D）。此外，研究了RCN 1抑制对细胞迁移和侵袭的影响。伤口愈合测定的定量分析表明，RCN 1敲低显著降低伤口愈合速率，表明细胞迁移显著受损（图9E）。此外，Transwell迁移和侵袭测定证实，LUAD细胞的迁移和侵袭能力在RCN 1敲低后显著降低（图9F）。这些结果强调了RCN 1在促进LUAD细胞增殖、迁移和侵袭中的关键作用，将RCN 1定位为治疗LUAD的潜在治疗靶点。总结 作者基于m6A相关PCD基因开发了一种13基因风险特征，证明了对LUAD患者生存结局和药物敏感性的强大预测能力。值得注意的是，RCN 1被鉴定为显著影响癌症进展的关键癌基因，并作为有希望的治疗靶点。虽然这些发现值得在不同的LUAD队列中进一步验证，但它们有可能为LUAD的个性化预测方法和精确治疗提供新的预后生物标志物和见解，最终指导个性化治疗策略以改善患者结局。
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