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在这项研究中，作者旨在通过三步选择过程来选择有效的工具。作者提取了 26,597个独立的顺式作用 eQTL，这些eQTL与14个不同免疫细胞中16,597个基因的表达水平相关（在 OneK1K 队列的 982 名参与者中测量的单细胞基因表达数据），并将它们用作本研究的候选遗传工具（图1）。鉴于单细胞测序数据的复杂性，在这项研究中，特定免疫细胞类型中基因的表达水平被记录为该基因的基因表达谱。
对于仪器选择，作者通过以 0.01 的 LDr 2 截止值进行连锁不平衡（LD）聚集来去除高度相关的遗传变异。来自 1000 基因组计划的欧洲人被用作 LD 参考面板。聚集后，共选择了17,959 个独立的顺式-eQTL，在14种细胞类型中表达了 16,597个基因（图2a）。其次，作者计算了每个eQTL的F统计量，并从进一步分析中排除了 20 个具有 F-statistics<10 的 eQTL，因为它们可能存在潜在的弱仪器偏倚。第三，作者使用 Steiger 滤波来验证仪器的方向性。这种方法测试了eQTL 是否解释了暴露（基因的基因表达谱）比结果（COVID-19）更多的方差。作者所有的 cis-eQTLs 都显示出正确的方向性，并被保存为有效的工具。总之，已选择 14 个免疫细胞中 16,597 个基因表达水平的 17,939 个 eQTL 作为 MR 分析的有效工具。在仪器选择前后，作者的仪器和 eGenes（其中 eGene 是指具有一个或多个 eQTL的基因）在CD4初始和中枢记忆T细胞中持续富集（CD4 NC; 图2a和b），其中CD4 SOX4和浆细胞显示仪器和 eGenes 数量最少。然后，作者使用双样本 MR 估计了 14 种免疫细胞类型中基因表达谱对 COVID-19 结果的推定因果影响。从 COVID-19 遗传住房倡议 GWAS 荟萃分析第 7 轮 （https://www./results/r7/） 中提取了四种类型的 COVID-19 结果数据，包括“非常严重的呼吸道确诊 COVID-19 与人群”（标记为“A2”，N 病例 = 13,769，N 对照 = 1,072,442）;“住院 COVID-19 与人群”（“B2”，N 例 = 32,519，N 对照 = 2,062,805）;“COVID-19 vs. 人群”（“C2”，N 病例 = 122,616，N 对照 = 2,475,240）和“住院 COVID-19 与未住院 COVID-19”（“B1”，N 病例 = 16,512，N 对照 = 71,321）组（参见图1 中的“结果选择”）。对于COVID-19 结局，仅使用欧洲血统参与者的 GWAS 汇总统计。对于“住院COVID-19 与未住院 COVID-19”（B1），仅欧洲数据的 GWAS 汇总统计数据未公开可用，因此作者使用了来自混合人群的数据，其中欧洲人的比例在该数据中为 81%。在协调暴露数据（测试基因的基因表达谱）和结果数据（COVID-19 结果）后，分别针对四种类型的 COVID-19 结果计算了 14,249-14,485 个 COVID-19 基因表达的 MR 估计值（图 3a）。在错误发现率 （FDR） 校正后，共有 144、3、191 和 40 个 MR 关联（这意味着一种基因表达谱与一种类型的 COVID-19 结果与 MR 和共定位证据的关联）对于 A2（“非常严重的呼吸道确诊 COVID-19 与人群”）、B1（“住院 COVID-19 与未住院 COVID-19”）， B2（“住院 COVID-19 与人群”）和 C2（“COVID-19 与人群”）分别为（图 3a）。为了检查 MR 结果的异质性，作者对由两个或多个工具估计的 16 个 MR 关联进行了 Cochran Q 检验，发现几乎没有证据支持工具之间的异质性 （Q 值>0.05）。为了通过连锁不平衡 （LD） 区分因果关系和混杂，作者应用了两种共定位方法，LD 检查、遗传共定位、Susie和SharePro共定位。这些分析表明，378 个 MR 关联中有 343 个（91%）显示共定位证据（定义为共定位概率 ≥70% 或 LD 检查的 r2 ≥ 0.7;Susie 和 SharePro 共定位概率>0.9; 图3a）。这 343 个 MR 关联与 14 种免疫细胞类型中 132 个基因的表达有关。
作者在 10 个数据库中对 COVID-19 相关基因以及25项 COVID-19 相关 MR 研究进行了全面搜索。作者发现，在已鉴定的 132 个基因中，有 58 个之前没有报道过 COVID-19（图 3a）。在比较四种 COVID-19 结局之间的 MR 关联时，作者发现54个基因在两个或多个 COVID-19 结局中显示出 MR 和共定位证据。一个基因 NBEAL2 在 4 个 COVID-19 结果中显示出证据，12 个基因在 3 个结果中显示出证据，其中 41 个基因在 2 个结果中显示出证据（图 3b）。例如，NBEAL2 基因在所有四种类型的 COVID-19 结果中都显示出强大的 MR 和共定位证据（图 3c-e）。这 54 个基因显示与两个或多个 COVID-19 结果相关，被认为是与 COVID-19 相关的可复制基因。基因表达对 COVID-19 结局的免疫细胞类型特异性影响作者进一步估计了 132 个推定的 COVID-19 致病基因的细胞类型特异性，其中总共包括 343 个 MR 关联 （200 个基因-COVID-19 对）。其中，200 对中的 145 对 （73%） 仅在一种特定免疫细胞类型中显示出对 COVID-19 的影响（图 4a）。同样，54 个可复制基因中有 30 个（56%）（在两个或多个 COVID-19 结果中具有强有力的 MR 证据）仅在一种免疫细胞类型中显示出细胞类型特异性作用（图 4b）。相比之下，7个基因在5种或更多免疫细胞类型中显示出 MR 关联，例如 13 种免疫细胞类型的 TOMM7 表达与 COVID-19 相关。这意味着这些基因对 COVID-19 具有普遍的免疫介导作用（图4b）。
细胞类型特异性 MR 分析提供了一些证据，支持 CD4 NC 细胞是 COVID-19 的富集细胞类型。然而，作者还观察到 CD4 NC 具有最多的 eGenes （图 2a 和 b）。然后，作者估计了 14 种免疫细胞类型中每一种已鉴定的致病基因数量与 eGenes 数量之间的比率（图 4c）。结果表明，在调整 eGenes 数量的影响后，COVID-19 相关基因富集于自然杀伤 （NK） 募集、血浆和 CD4 SOX4 细胞三种免疫细胞类型中。相比之下，该图在一些其他细胞类型（如 NK 细胞）中被去富集。通过函数 'phyper' 使用另一种富集方法，该图与图 4c 中的图一致。免疫病毒相关机制中 COVID-19 相关基因的富集为了探索由已鉴定的 COVID-19 相关基因富集的免疫介导机制，作者进行了一组功能富集分析，包括本体亚型、通路分析和基因亚型分析。在与 COVID-19 相关的 132 个基因中，119 个基因可以转化为 Entrez 基因 ID 并被纳入富集分析。结果表明，这 119 个基因富含干扰素信号传导、免疫系统中的细胞因子信号传导和干扰素 α/β 信号传导等途径，与之前研究中报告的结果一致。富集结果可分为六种类型的生物途径：病毒反应途径、免疫炎症途径、细胞过程途径、代谢过程途径、对刺激的反应和疾病途径（图5a）。然后，作者对已鉴定的致病基因进行了蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络分析。在本分析中包含的 119 个基因中，它们编码的 15 个蛋白质几乎没有与任何其他蛋白质相互作用的证据，剩下 104 个蛋白质编码基因用于 PPI 分析。使用 Metascape 将 104 种基因编码蛋白中的 34 种（33%）进一步聚类为4个模块（图 5b）。
鉴于确定了 COVID-19 的潜在免疫相关药物靶点，作者进行了两项分析。首先，作者在 PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm./） 和现有的药物-基因相互作用数据库（包括 OpenTargets、DrugBank和Drug-gene interaction database）中检索了靶向 132 个已鉴定基因的药物。该检索确定了 32 种候选药物，靶向已鉴定基因中的 24 种。这 32 种药物的主要适应症是慢性咳嗽、各种类型的疼痛（神经性、肌肉骨骼和炎症性）、肿瘤和脂质代谢异常，这些是 COVID-19 感染和 COVID 后遗症患者出现的症状。已确定的24个基因中有10个是未报告的基因，这些基因在以前的任何研究中都没有报道，其中 90% 显示出对严重 COVID-19（A2 和 B2 组中“非常严重和住院的 COVID-19 病例”）的影响，8个基因仅在一种特定细胞类型中显示 MR 关联。结合从本研究中获得的上述证据，使用以下标准来确定 COVID-19 有前途的药物靶基因：（i） 该基因显示 MR 和共定位，以支持其作为 COVID-19 的推定致病基因，并且以前的研究没有报道（因此它必须是一个未报道的基因， 如果该基因也是可复制基因，则会获得额外的分数）;（ii） 未报道的基因在相关通路中富集或包含在四个聚类模块中;（iii） 该基因显示与 SARS-COV-2 蛋白的预测相互作用和/或与 COVID-19 现有宿主蛋白的关联;（iv） 该基因是可成药基因（作为现有药物的靶点或作为可成药靶点）。对于 58 个具有 MR 和共定位证据以支持其因果关系的未报道基因，作者根据上述标准将它们分为三个等级。18 个基因被列为 1 级药物靶点 （总分 ≥1）。23 个基因，包括 19 个蛋白质编码基因和 4 个非编码基因，被列为 2 级靶标（总分在 0.35 和 1 之间），其余靶标被列为 3 级靶标。除 4 个非编码基因外，其余 37 个 Tier 1 和 Tier 2 基因被视为 COVID-19 有前途的药物靶点基因 （图 6）。其中，NCR3 被评为最高候选基因，得分最高为 2.1，这在所有测试标准中都显示了良好的证据。同样，EHMT2 、 RHEB 和 HSPA1B 也显示出来自多个标准的良好证据 （总分在 1.85 到 1.95 之间）。
总结 作者进行了单细胞 eQTL MR 和共定位分析，以研究 14 种免疫细胞类型的基因表达对 COVID-19 严重程度风险的推定因果影响。进一步应用宿主-病原体蛋白相互作用的功能富集分析和预测来确定参与 COVID-19 病理生理学的免疫介导的致病基因和网络。将遗传证据与临床试验信息相结合，作者开发了一个分层系统，以优先考虑 COVID-19 的免疫介导药物靶点。
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