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GSE 221521数据集在DR组和对照组之间获得784个DEG（492个DEG上调，292个DEG下调）（图1A）。另一方面，在GSE 221521中，DR组中的MPRGs评分显著高于对照组（p< 0.05）（图1B）。通过WGCNA分析，分层聚类分析显示有1个离群样本并将其排除（图1C）。当选择软阈值β为12时，网络近似于无标度分布（图1D）。在确定软阈值后，进行共表达网络的构建，并聚合7个模块（图1E）。在非灰色模块中，p值< 0.05，与该a评分相关|Cor|> 0.3。通过对关键模块的识别，作者得到了MEturquoise和MEyellowed模块。与MPRGs评分最显著相关的模块之一是MEturquoise（cor = 0.7048，p= 5.24 × 10- 18），它包含7,423个基因。另一方面，最高的负相关是MEyellowed（cor =-0.3491，p= 2.68 × 10- 4），其包含1，191个基因。(Fig.1F）。总共获得了8，614个模块基因。在GS和MM之间以高度显著的相关性获得了总共782个模块基因（图1G，H）。从784个DEG和1，136个MRG的交叉获得总共26个DE-MRG，并且从784个DEG和782个模块基因的交叉获得63个DE-MPRG（图2A、B）。最后通过斯皮尔曼相关分析得到88个基因作为候选基因，|R| 05）（图2C）。88个候选基因的GO途径分析导致211个生物过程（BP）条目的鉴定。GO通路包括线粒体内膜、核糖体、线粒体自噬、蛋白质定位的负调控和胞内蛋白质转运的调控、未折叠蛋白结合等（图2D）。此外，还鉴定了4种KEGG途径，它们是核糖体、RNA聚合酶、线粒体自噬动物和核苷酸切除修复（图2E）。PPI网络由34个蛋白质和45条边组成，RPS 11和RSC 1A1与其他蛋白质有更多的连接和相互作用（图2F）。 以88个候选基因作为暴露因子，以DR作为结果，进行双样本MR分析。通过IVW筛选出13个基因作为关键基因（p< 0.05）。结果，获得了6个保护因子：RPL 28、RPL 36、ATP 5F1E、PRPF 31、PET 100、SEPTIN 4（OR < 1，p< 0.05），而PTAR 1、CYP 27 A1、SLC 4A8、SLC 25 A34、FGD6、LDHD、GAN基因是风险因子（OR > 1，p< 0.05）（图3A）。以散点图分析暴露因素与结局的相关性，PTAR 1、CYP 27 A1、SLC 4A8、SLC 25 A34、FGD 6、LDHD和GAN基因呈正相关，RPL 28、RPL 36、ATP 5F1 E、PRPF 31、PET 100和SEPTIN 4基因呈负相关。森林图显示，RPL 28、RPL 36、ATP 5F1E、PRPF 31、PET 100和SEPTIN 4基因的效应值小于0，PTAR 1、CYP 27 A1、SLC 4A8、SLC 25 A34、FGD 6、LDHD和GAN基因的效应值大于0。SNP数量在IVW线的两侧基本对称，并且与孟德尔第二定律一致。对13个暴露因素和结局进行敏感性分析，发现13个暴露因素无异质性（p> 0.05），13个暴露因素和结局之间不存在水平多效性（p> 0.05）。在LOO中，没有没有严重偏倚的点，并说明了结果的可靠性。最后以DR为暴露因素，13个基因为结局，进行Steiger反向因果关系检验，方向关系判定为“TRUE”，13个暴露因素与结局之间无反向因果关系（p< 0.05）。最后，将RPL 28、RPL 36、ATP 5F1E、PRPF 31、PET100、SEPTIN 4、PTAR 1、CYP 27 A1、SLC 4A8、SLC 25 A34、FGD 6、LDHD、GAN作为关键基因记录。PTAR 1和SLC25A34作为DR生物标志物的建立为了进一步识别生物标志物，SVM和Boruta分析中都包括13个关键基因。在Boruta算法中，鉴定出11种候选生物标志物（图3B）。在SVM-RFE内，筛选13个基因产生11个候选生物标志物（图3C）。然后，通过重叠这两组候选生物标志物，将SLC 25 A34、GAN、RPL 36、FGD 6、PTAR 1、PRPF 31、SLC 4A 8、ATP 5 F1 E、PET 100、CYP 27 A1鉴定为候选生物标志物（图3D）。随后，绘制GSE 221521和GSE 160306中这10种候选生物标志物的ROC曲线，以评估它们区分DR和对照组群的能力。然后在两组中选择2种候选生物标志物（AUC ≥ 0.7），其为PTAR 1和SLC 25 A34（图3E、F）。在GSE 221521和GSE 160306数据集中，PTAR 1、SLC 25 A34表达趋势一致且显著，并且两者在DR中显著上调（图3G、H）。因此，将PTAR 1和SLC 25 A34记录为生物标志物用于后续分析。DR中的PTAR 1和SLC 25A34诺模图诊断在GSE 221521中，通过列线图发现PTAR 1和SLC 25 A34对DR具有更好的诊断能力（图4A）。诺模图的净效益高于其他单个因素，表明诺模图具有最佳预测（图4B）。诺模图模型的曲线下面积AUC为0.745，表明其是DR发生的良好可靠性预测模型（图4C）。22个免疫细胞的浸润结果显示在图4D中。首先根据75%的样本中表达为0的22个免疫细胞，13个免疫细胞，（初始B细胞、记忆B细胞、CD 8 + T细胞、CD 4+记忆静息T细胞、CD 4+记忆激活T细胞、滤泡辅助T细胞、调节（T细胞）T细胞、静息NK细胞、激活NK细胞、单核细胞、M2巨噬细胞、激活肥大细胞，DR组与对照组相比，NK细胞和单核细胞的活性有显著性差异（p < 0.05），对照组中NK细胞活性显著上调，而单核细胞活性显著上调。(Fig.4E）。此后，这些免疫细胞与生物标志物之间的相关性显示，PTAR 1（cor =-0.41，p= 3.96 × 10-6）与活化的NK细胞表现出最强的正相关性。(Fig.4F）。作者使用GSEA来探索生物标志物影响DR发展的途径。在GSE 221521数据集中（p< 0.05），SLC25A34主要富集到58个KEGG通路。这些途径包括蛋白质合成过程如核糖体、神经退行性疾病如帕金森病以及NOTCH和胰岛素信号传导途径（图4G）。PTAR 1主要富集到19条KEGG通路。这些信号通路包括磷脂酰肌醇、神经营养因子、ERBB、Toll样受体、胰岛素信号通路。SLC25A34和PTAR 1均参与溶酶体途径和胰岛素信号传导途径（图4H）。PTAR1和SLC25A34都参与溶酶体途径和胰岛素信号传导途径。首先，对生物标志物进行染色体定位分析，9号染色体上的SLC25A34基因和1号染色体上的PTAR 1基因（图5A）。为了理解皮肤组织和细胞中生物标志物的表达，PTAR 1在组织中富集，并且表达它的前五个组织是骨髓、胸腺、甲状旁腺、肾和肝（图5D）。此外，SLC25A34在舌中的表达量最高，其次是骨骼肌、十二指肠、小肠等（图5E）。为了进一步理解生物标志物的RNA甲基化修饰，在最高置信度的位置（1461）进行SLC25A34 m6A基因座的预测（图5F），而在最高置信度的位置（824）进行PTAR1 m6A基因座的预测（图5G）。SLC25 A34和PTAR 1二级结构m6 A基因座的预测结构随后显示在图5B、C中。GGI网络显示与异戊烯基转移酶活性和异戊烯化功能相关的生物标志物（图6A）。将从miRDB数据库和TargetScan数据库获得的miRNA进行交叉，得到23个与生物标志物相关的上游miRNA和17个lncRNA（图6B，C）。之后，为了了解转录因子（TF）与生物标志物之间的调控关系，其中有12个TF调节SLC25A34，而有28个TF调节PTAR 1，包括42个节点和40个边缘（图6D）。总结 将784个DEG分别与1136个MRG和782个MPRG进行交叉，筛选出89个相关基因作为候选基因。MR分析产生了13个与DR具有明确因果关系的关键基因。在 GSE221521 和 GSE160306 中，PTAR 1和SLC25A34的表达趋势在DR组群和对照组群之间是一致和显著的。因此，PTAR 1和SLC 25A34被用作生物标志物。免疫浸润分析显示，DR组与对照组的活化NK细胞和单核细胞有显著性差异，PTAR 1与活化NK细胞呈正相关。两种生物标志物均富集于溶酶体和胰岛素信号通路中。GGI网络显示，生物标志物与异戊烯基转移酶活性和异戊烯化功能相关。
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