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在酶工程领域，有两个研究方向虽常被相提并论，却在本质上大不相同：酶的从头设计（de novo design）与功能增强突变挖掘（function-enhancing mutation identification）。前者追求在空白序列空间中设计具备催化功能的全新酶，是对自然从未涉足之“蛋白宇宙”的探索；而后者则着眼于在现有天然酶的基础上，通过精确突变实现功能提升，是对进化路径的干预与调控。 值得注意的是，功能增强突变挖掘并不一定比酶的从头设计容易。其最大挑战来自突变组合空间的指数增长：哪怕只在一条中等大小的酶链上引入五个位点突变（约占总氨基酸数的1–2%），可行的氨基酸组合数量就已超过百万。 随着近年来人工智能（AI）技术在蛋白质工程领域的广泛应用，通过深度学习与大规模数据训练，人工智能技术在突变体的初步筛选中展现出显著的效率提升。然而，AI模型本质上依赖于已有数据分布，面对低数据密度区域时易出现预测偏差。范德堡大学杨中悦课题组认为，酶的细分功能数据的稀疏性，决定了AI模型未来将不可避免地进入“数据饱和”的增长瓶颈期。在此背景下，他们认为将基于物理原理的建模方法与AI工具深度融合，会是突破现有限制、提升模型泛化能力的关键策略。 近日，该课题组的邵乾真等同学在Chem Catalysis发表了题为“SubTuner leverages physics-based modeling to complement AI in enzyme engineering toward non-native substrates”的工作，介绍了他们主导开发的一项创新性研究工具——SubTuner，这是首个基于科学假设驱动的功能增强突变识别平台。 SubTuner集成于其之前开发的高通量物理建模平台EnzyHTP，以三条明确的物理假设为筛选核心：（1）突变体需具备良好的热稳定性；（2）能有效结合反应的过渡态类似物；（3）通过优化活性位点电场，稳定反应偶极，降低反应能垒。SubTuner通过系统性物理计算，预测能提升酶对非天然底物催化能力的关键突变，性能全面优于目前最新的AI与生物信息学工具。
图一，SubTuner的工作流 为验证SubTuner的实用性，研究人员设计了三个体系展开评估，并引入两个定量指标：命中率（有效突变数/推荐突变数）和功能增强速度（最高活性倍数/总筛选周期）。 在Arabidopsis thaliana的AtHOL1甲基转移酶催化乙基碘化物（EtI）的案例中，SubTuner推荐了10个突变体，其中3个（V23T、V140C、V140T）被实验验证为有效，命中率达30%，相比随机实验提升14倍，且突变体V140T的催化活性提升达5.3倍，筛选效率超过位点饱和突变实验5倍以上。 在Aspergillus clavatus来源的acl-MT甲基转移酶案例中，面对更大的底物和复杂的多点突变空间，SubTuner在600个突变体中精准推荐10个突变方案。实验结果显示，突变体对EtI、正丙基碘化物、环丙甲基碘化物、对苯乙基碘化物的催化活性分别提升14倍（命中率11%）、48倍（20%）、37倍（30%）和65倍（30%），整体筛选速度较SOLD库方法提升40倍以上。 此外，研究团队还利用SubTuner对AtHOL1进行结构位阻较大的底物（如丙基碘化物、异丙基碘化物、烯丙基碘化物）适配突变的前瞻性预测，成功发现V140T、P20M、P20C等突变体，分别对底物催化活性提升3–5倍，命中率达33%。
图二，SubTuner在acl-MT上的测试结果 借助筛选过程中产生的分子模拟数据，研究人员进一步解析了突变体活性提升的机制。例如，V140T突变引入新的氢键网络，降低了空间位阻，同时改善底物与活性位点电场的空间对齐，从而有效稳定反应偶极，解释了其催化效率的显著提高。这一机制层面的理解也为今后更精准的功能突变设计提供了明确的物理指导原则。更重要的是，这种机制洞察体现了SubTuner方法与传统实验筛选策略的根本区别。在传统的酶工程实践中，研究人员往往只能依赖实验结果本身做出判断，筛选过程黑箱化，缺乏机制解析空间，被动接受所谓的“蛋白工程第一定律”——you get what you screen for。而SubTuner通过高分辨率的物理建模，在每一次筛选中都同时生成可供解释的模拟数据，使研究人员能够从突变体的物理化学特征出发，理解为何某个突变有效，从而实现理性迭代设计。这种方式打破了传统“盲筛”的局限，使酶工程从经验驱动转向理论指导，让设计者不再只是“获取筛选结果”，而是“从筛选中学到更多”——you get more than what you screen for。
图三，不同AtHOL1突变体和底物复合物中的电场 在多模型对比中，研究团队进一步将SubTuner与现有主流AI工具（如FuncLib, TurNup, DLKcat, MODIFY）进行性能对比。结果显示，SubTuner在预测准确度、功能提升幅度、突变体多样性等关键指标上均优于上述工具，表明其不仅可以补足AI筛选的不足，更能作为AI之后的物理建模“精修引擎”，助力构建更高质量的突变体库。  表一，各工具预测的10个针对不同底物活性的有利突变以及其实际活性 ——小结—— 这项研究表明，以科学假设为核心、融合物理建模与高通量计算的SubTuner平台，有望成为推动酶工程走向系统化、精准化的关键工具。正如作者所指出的，物理模型与AI的深度融合，将开启酶催化设计的新纪元，帮助科学家们更快速、更可靠地拓展酶的底物适用范围，释放酶催化在医药、材料与可持续制造等领域的巨大潜力。 作者：杨中悦课题组
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