【原】不读完这篇，都不敢说自己懂单细胞质控！

单细胞系列如约进行！前面一期我们介绍了单细胞的双细胞质控（有手就会的scRNA-seq第5期｜还在纠结双细胞质控方法吗！一文说清楚），加上之前在“有手就会的scRNA-seq ｜3.质控思路”中对于nFeature, 线粒体比例等的质控要点，我们的数据质量已经得到的基本保障，不过在正式进入后续分析之前，我们还需要关注一些其他质控。

本期我们将介绍其他质控的几个关键部分：

1. 细胞周期的识别、矫正及操作代码

推荐适用情况：常规可运行该步骤进行评分计算，在细胞间细胞周期差异大且非研究范畴时，需矫正）。

2. EmptyDrops识别空液滴简介

推荐适用情况：非10X数据或10X Cellranger过滤质量不高时，或多组学数据时候。

3. SoupX去除环境RNA简介

推荐适用情况：①当发现数据中存在异常的高表达背景基因（如血红蛋白基因、组织特异性基因等）或在实验过程中有污染可能性；②比较原始计数矩阵和过滤后矩阵，发现空液滴中是否有显著的RNA信号；③UMAP图不干净存在杂点时可尝试运行。

这些质控将为后续分析打下更坚实的基础！

往期回顾：

（一) 单细胞测序带脑学习版

单细胞测序 | 第1期. 单细胞测序：揭开生命奥秘的钥匙

单细胞测序 | 第2期. 下游数据质控知多少

单细胞测序 | 第3期. Seurat之PBMC分析标准化流程

单细胞测序 | 第4期. 写文章时需要用到的单细胞转录组测序原理

单细胞测序 | 第5期. 单细胞测序文件面面观

单细胞测序 | 第6期. 10X genomics 上游分析-cellranger介绍

单细胞测序 | 第7期. 10X genomics 上游分析-cellranger应用

单细胞测序 | 第8期. 一文打通单细胞测序研究思路

单细胞测序 | 第9期. Zenodo一个宝藏公共数据库和单细胞的不解之缘

单细胞测序 | 第10期. 生物信息学必须了解的数据库

单细胞测序 | 第11期. 不会还有人不知道这个免费一年的云服务吧！？

单细胞测序 | 第12期. 单细胞分析数据下载、导入和合并

单细胞组学 | 第13期. 单细胞测序中竟然存在双细胞？

单细胞组学 | 第14期. 想发单细胞测序文章？这一步必学！

单细胞组学 | 第15期. 一份强烈推荐收藏的细胞周期校正宝典！

单细胞组学 | 第16期. 不可不知的单细胞流程

单细胞组学｜第17期. 找到Cluster的领头羊

单细胞组学｜第18期. 单细胞注释不再是烦恼！

单细胞组学｜第19期. 单细胞数据分析的核心环节，必学！

单细胞组学 | 第20期. 美无极限——卷起来的UMAP图美化方案

单细胞组学 |  第21期. 点亮数据星空——Dotplot图绘制技巧揭秘

单细胞组学 |  第22期. 单细胞转录组基础分析流程详解

单细胞组学 | 第23期. 单细胞数据分析的灵魂，学起来！

单细胞组学 | 第24期. 找到属于你的细胞亚群！

单细胞组学 ｜第25期. 单细胞亚群细分

单细胞组学｜第26期. 一个函数搞定单细胞富集分析！

单细胞组学｜第27期. 想发高分？干湿结合才是王炸！

单细胞组学 | 第28期. 拟时序分析，看这里！

（二) 单细胞测序有手就会版

1. 单细胞思路 | 第1期 必学习的最常规的单细胞思路！

2. 单细胞思路 | 第2期 单细胞中的资源库

3. 单细胞思路 | 第3期 找到靶点分子后可以直接测序！

4. 单细胞思路 | 第4期 预测标志物，单细胞和疾病稳稳联系！

5. 有手就会的scRNA-seq | 1.数据导入

6. 有手就会的scRNA-seq | 2.认识Seurat对象

7. 有手就会的scRNA-seq｜3.质控思路

8. 有手就会的scRNA-seq｜4. 为什么老是画不好小提琴图？

9. 有手就会的scRNA-seq｜5. 还在纠结双细胞质控方法吗！一文说清楚

TS

01

细胞周期的识别与矫正

在单细胞数据中，细胞周期的不同阶段（G1、S、G2/M）会导致与细胞周期相关基因的表达量发生显著变化。这种变化可能会掩盖其他生物学差异信号（如细胞类型、疾病状态等），导致误将细胞周期效应解释为生物学差异。

因此，常规我们都可以进行细胞周期相关评分计算，在判断出数据中的细胞之间细胞周期相关基因表达差异分布大，而且并非我们研究范畴时，就需要矫正。

那么，如何识别细胞的细胞周期呢？

Seurat内置的CellCycleScoring函数通过计算细胞周期相关基因的表达量，为每个细胞分配一个周期评分，从而推断细胞所处的细胞周期阶段（G1、S、G2/M）。再通过主成分分析（PCA），可以评估细胞周期相关基因对数据变异的贡献程度：如果细胞在PCA图中按细胞周期阶段分组，说明细胞周期效应对数据变异贡献较大（如图1），且细胞周期不是研究目的情况下，则需要对其进行校正，以避免掩盖其他生物学信号。

图1 需要矫正的细胞周期

校正方法：可以通过回归分析、去除细胞周期基因或使用特定算法（如Seurat中的ScaleData函数）来消除细胞周期效应。矫正后细胞周期相关基因在细胞之间的差异性就会降低，而促使后续分析（比如聚类、差异表达）更聚焦于细胞类型或生物学状态的差异，而不是被细胞周期的“噪声”干扰（如图2）。

图2 矫正后的细胞周期

TS

02

细胞周期实操代码

1. 加载R包及准备Seurat对象

library(Seurat)
library(tidyverse)

Seurat_obj <- CreateSeuratObject(counts = Seurat_obj) %>%
  NormalizeData() %>%
  FindVariableFeatures(selection.method = "vst") %>%
  ScaleData(features = rownames(Seurat_obj)) %>%
  RunPCA()

2. 计算细胞周期评分并展示结果

# 提取细胞周期基因
s.genes <- cc.genes.updated.2019$s.genes  # S期基因
g2m.genes <- cc.genes.updated.2019$g2m.genes  # G2M期基因

# 计算细胞周期评分
Seurat_obj <- CellCycleScoring(Seurat_obj, 
                                   s.features = s.genes, 
                                   g2m.features = g2m.genes, 
                                   set.ident = TRUE)

# 展示PCA结果
Seurat_obj <- RunPCA(Seurat_obj, features = c(s.genes, g2m.genes))
DimPlot(Seurat_obj, reduction = "pca", group.by = "Phase")
DimPlot(Seurat_obj, reduction = "pca", group.by = "Phase", split.by = "Phase")

3. 若需矫正细胞周期

# 对Seurat对象进行标准化，并回归去除S期和G2M期评分的影响
Seurat_obj <- ScaleData(Seurat_obj, 
                        vars.to.regress = c("S.Score", "G2M.Score"), 
                        features = rownames(Seurat_obj))

# 使用S期和G2M期相关基因进行主成分分析（PCA）
Seurat_obj <- RunPCA(Seurat_obj, features = c(s.genes, g2m.genes))

DimPlot(Seurat_obj, cols = pal_npg("nrc", alpha = 0.7)(3))

校正方法：使用我们一开始的Rdata素材的同学（有手就会的单细胞转录组 | 第1期.数据导入）可以发现本数据是不需要矫正细胞周期的。

图3 示例数据的细胞周期结果，无需矫正

TS

03

EmptyDrops去除空液滴

目前Cellranger本身也集成了EmptyDrops算法，从而更好地区分低UMI的细胞和空液滴，大多数情况下已经足够，我们并不需要再单独进行该方法进行计算，此处介绍一下其基本原理：

EmptyDrops通过比较每个barcode的基因表达谱与随机背景液滴的分布（蒙特卡洛模拟），计算其偏离背景的显著性（p值）。用户可设定UMI阈值（如lower=100）区分真实细胞与空液滴。

不过Cellranger仅限于10x Genomics测序，而EmptyDrops可适配其他平台；此外，在涉及单细胞多组学的时候，背景RNA分布更复杂，有文章证明单独运行EmptyDrops可能更优（可参考下方文献）。

经典引用文献：

1. Genome Biol 22, 329 (2021). https:///10.1186/s13059-021-02547-0                                                                                                                             

2. Genome Biol 25, 121 (2024). https:///10.1186/s13059-024-03259-x                                                                                                           

TS

04

去除环境RNA污染

由环境或邻近细胞破损或者凋亡细胞释放的外源 RNA可能会混入测序数据中，因此影响数据的准确性。针对这一问题常用工具有SoupX、Decont X（R语言）、CellBender（Python环境）等。

其原理是：通过分析空液滴中的 RNA 表达，估计环境 RNA 的表达谱，然后从每个细胞的表达矩阵中扣除环境 RNA 的贡献。

SoupX在众多文献中被使用，也推荐大家运用到自己的数据中。

经典引用文献：

1.https://github.com/constantAmateur/SoupX GigaScience, Volume 9, Issue 12, December 2020, giaa151, https:///10.1093/gigascience/giaa151                                     

2.Genome Biol 24, 140 (2023). https:///10.1186/s13059-023-02978-x                                                                                                                                          

此外还有同样使用R语言的Decont X，操作方法也很简单，大家可以在下方教程中进行学习。相比较而言，Soup X更适用于10X Genomics数据以及有背景液滴数据（未过滤的原始数据）的情况。

1.https:///packages/devel/bioc/vignettes/decontX/inst/doc/decontX.html

Summary：

本期我们介绍了单细胞一些容易被忽视的质控内容，包括双细胞质控、EmptyDrops去除空液滴以及去除环境RNA，自此质控部分已经完成，下一期我们将进行数据整合和降维聚类部分，下一期不见不散！

这就是本期的全部内容啦，你学会了吗？后续我们将继续开始为大家分享单细胞转录组学相关内容。大家对于推送内容有任何问题或建议可以在公众号菜单栏“更多--读者的话”栏目中提出。希望我们能一起成长，共同进步，让医学科研有迹可循！

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