【原】【Hortic Res】SmWRKY32-SmbHLH65/SmbHLH85调控模块介导丹参中丹参酮的生物合成

题目：The SmWRKY32-SmbHLH65/SmbHLH85 regulatory module mediates tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza

刊名：Horticulture Research

作者：Bin Zhang, Juane Dong et al.

单位：Northwest A&F University, Yangling 

日期：25 March 2025

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摘要

丹参酮是丹参中发现的有价值的化合物，深入了解其转录调控机制是增加其含量的关键策略。先前的研究表明，SmWRKY32是丹参酮合成的阻遏物。

本研究鉴定了SmbHLH65转录因子，其在SmWRKY32过表达转录组中的表达显著降低。SmbHLH65的过表达刺激了丹参酮的积累，而其沉默导致丹参酮含量降低。然而，SmbHLH65并不直接靶向参与丹参酮合成的关键酶基因。

随后，我们发现了SmbHLH65相互作用蛋白SmbHLH85。SmbHLH85通过直接上调SmDXS2和SmCPS1促进丹参酮的生物合成。

进一步的研究表明，SmbHLH65不仅促进SmbHLH85的表达，而且增强其与SmDXS2和SmCPS1启动子的结合，从而增强这些生物合成基因的激活。

此外，SmWRKY32直接结合SmbHLH65启动子以抑制其活性。总之，这些发现表明，调节模块SmWRKY32-SmbHLH65/SmbHLH85控制着丹参中丹参酮的合成。本研究揭示了一种新的转录调控机制，为控制丹参酮生物合成的复杂网络提供了新的见解。

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技术路线

• 基因克隆：从丹参cDNA中克隆SmbHLH65（ORF 933 bp）和SmbHLH85（ORF 735 bp），使用特异性引物（表S1）。

• RNA提取与qRT-PCR

• 亚细胞定位

• 转基因毛状根构建

• 载体设计：

• 过表达：pK7WG2R-SmbHLH65/SmbHLH85。

• RNA干扰（RNAi）：pK7GWIWG2R-SmbHLH65/SmbHLH85。

• 转化与筛选：农杆菌介导转化丹参叶片，通过基因组PCR筛选阳性毛状根，qRT-PCR验证基因表达水平（图S1）。

• 丹参酮含量测定

• 文库筛选：以SmbHLH65为诱饵（pGBKT7载体），筛选丹参cDNA文库，获得互作蛋白SmbHLH85。

• 验证：共转化酵母菌株EGY48，SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基筛选互作。

• Pull-down实验

• 荧光互补成像（LCI）

• 构建SmbHLH65-nLUC和cLUC-SmbHLH85载体，共注射烟草叶片，化学发光检测荧光信号。

• 酵母单杂交（Y1H）

• 电泳迁移率变动分析（EMSA）

• 双荧光素酶报告基因（Dual-LUC）

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主要结果

3.1 SmbHLH65的克隆与功能验证

基因克隆与序列分析：从丹参cDNA中克隆SmbHLH65（ORF 933 bp），序列比对显示其含有保守的bHLH结构域和HER基序（His5-Glu9-Arg13）。

组织表达分析：qRT-PCR显示SmbHLH65在茎和根中高表达（图1B）。

亚细胞定位：SmbHLH65-GFP与核标记蛋白共定位，确认其定位于细胞核（图1C）。

转基因毛状根构建：过表达（SmbHLH65O）和RNAi（SmbHLH65R）毛状根通过农杆菌转化获得，qRT-PCR验证表达差异。

丹参酮含量检测：HPLC显示过表达株系总丹参酮（TT）增加2.9倍，RNAi株系下降45%（图2A）。

靶基因表达分析：qRT-PCR显示SmDXS2、SmCPS1等关键基因在过表达株系中显著上调（图2B）。

SmbHLH65在根中高表达（与丹参酮合成部位一致）。

过表达株系中SmCPS1表达量增加7.2倍，丹参酮IIA（TIIA）含量增加3.7倍。

SmbHLH65是丹参酮合成的正调控因子，但其不直接结合靶基因启动子（Y1H阴性结果），提示其通过间接机制发挥作用。

3.2 SmbHLH65与SmbHLH85的互作验证

酵母双杂交（Y2H）：以SmbHLH65为诱饵筛选丹参cDNA文库，鉴定出互作蛋白SmbHLH85（图3A）。

Pull-down实验：GST-SmbHLH85捕获His-SmbHLH65，Western blot验证互作（图3B）。

荧光互补成像（LCI）：SmbHLH65-nLUC与cLUC-SmbHLH85共注射烟草叶片，检测荧光信号（图3C）。

Y2H显示SmbHLH65与SmbHLH85在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基中生长。

LCI实验显示特异性荧光信号仅在互作组合中出现。

SmbHLH65与SmbHLH85形成异源二聚体，为后续功能协同调控提供结构基础。

3.3 SmbHLH85的功能及其直接靶基因鉴定

转基因功能验证：过表达SmbHLH85（SmbHLH85O）株系总丹参酮增加2.5倍，RNAi株系下降51%（图4A）。

靶基因筛选：qRT-PCR显示SmDXS2、SmCPS1在过表达株中分别上调5.8倍和7.2倍（图4B）。

Y1H与EMSA：SmbHLH85结合SmDXS2（-255~-242 bp）和SmCPS1（-950~-937 bp）启动子的E-box（图5A-B）。

双荧光素酶实验：SmbHLH85激活SmDXS2（1.7倍）和SmCPS1（2.5倍）启动子活性（图5C）。

EMSA显示GST-SmbHLH85与生物素探针结合，冷竞争实验验证特异性。

SmbHLH85过表达株系中SmDXS2和SmCPS1表达显著升高。

SmbHLH85通过直接激活SmDXS2和SmCPS1促进丹参酮合成，是代谢途径的关键调控节点。

3.4 SmbHLH65增强SmbHLH85的转录活性

EMSA竞争实验：GST-SmbHLH65增强SmbHLH85与SmDXS2/SmCPS1启动子的结合（图6A）。

双荧光素酶实验：SmbHLH65与SmbHLH85共表达时，SmDXS2和SmCPS1启动子活性分别增加2.1倍和3.0倍（图6B）。

表达调控分析：SmbHLH65过表达株系中SmbHLH85表达上调，反之亦然（图6C-D）。

SmbHLH65自身不结合靶基因启动子，但增强SmbHLH85的DNA结合能力。

共表达时，SmCPS1启动子活性比单独SmbHLH85时高20%。

生物学意义：

SmbHLH65通过物理互作增强SmbHLH85的转录激活能力，形成正向调控环路，放大靶基因表达。

3.5 SmWRKY32对SmbHLH65的转录抑制

转录组分析：SmWRKY32过表达株系中SmbHLH65表达显著下调（RNA-seq数据PRJNA1111010）。

Y1H与EMSA：SmWRKY32结合SmbHLH65启动子的W-box（-1474~-1461 bp）（图7B-C）。

双荧光素酶实验：SmWRKY32抑制SmbHLH65启动子活性（降低2.4倍）（图7D）。

EMSA显示GST-SmWRKY32与W-box探针结合，突变探针无竞争效应。

SmWRKY32过表达株系中SmbHLH65表达量下降60%。

SmWRKY32通过直接抑制SmbHLH65表达，间接削弱SmbHLH85的转录激活功能，形成丹参酮合成的负调控模块。

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结论

首次发现bHLH异源二聚体（SmbHLH65-SmbHLH85）在丹参酮合成中的协同调控作用。

揭示SmWRKY32通过抑制SmbHLH65间接调控丹参酮合成的分子机制。

为代谢工程提高丹参酮产量提供了新靶点（如增强SmbHLH85表达或抑制SmWRKY32）。

该论文系统解析了SmWRKY32-SmbHLH65/SmbHLH85模块调控丹参酮合成的分子机制，结合遗传学、分子生物学和生化实验，明确了各因子的功能及其相互作用网络，为药用植物次生代谢调控研究提供了范例。

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原文获取

原文链接：

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