第5章发酵工艺过程及其控制5.1概述1．发酵主要操作方式：根据发酵过程操作方式将工业发酵分为三种模式，即间歇发酵，连续发酵和流加发
酵。（1）间歇发酵：是最常见的工业发酵方式，也称分批发酵或批式发酵。将发酵罐和培养基灭菌后，向发酵罐中接入种子、开始发酵过程。
操作简单、不容易染菌、投资低；但生产能力低、劳动强度大产品质量不稳定。（2）连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，
同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。可长期连续进行，生产能力高；但操作控制要求高，
投资高、杂菌污染、微生物菌种变异。主要用于实验室进行发酵动力学研究，在工业发酵中应用不多见，只应用于菌种的遗传性质比较稳定的发酵
，如酒精发酵等。（3）流加发酵又称补料分批发酵，是介于间歇发酵与连续发酵的一种操作方式。它同时具备两者的部分优点，是一种在工业
上比较常用的操作方式。流加发酵的特点是在流加阶段按一定的规律向发酵罐中连续地补加营养物或(和)前体，由于发酵罐不向外排放产物，罐
中的发酵体积将不断增加，直到规定体积后放罐。补料分批发酵可分为两种类型：单一补料分批发酵和反复补料分批发酵。在开始时投入一定量
的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳源或(和)氮源或(和)其他必须基质，直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，停止
补料，最后将发酵液一次全部放出，这种操作方式称为单一补料分批发酵。反复补料分批发酵是在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时间按一
定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大操作容积，从而在理论上可以延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发
酵液全部放出。补料分批发酵作为分批发酵向连续发酵的过渡，兼有两者优点，且克服了两者缺点：可解除营养物基质的抑制、产物反馈抑制和
葡萄糖分解阻遏效应；可避免好氧发酵在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况；可在某
些情况下减少菌体生成量，提高有用产物的转化率。补料分批发酵技术在生产和科研上被广泛运用，包括单细胞蛋白、氨基酸、生长激素、抗生素
、维生素、酶制剂、核苷酸、有机酸等几乎整个发酵工业。2．发酵过程中的代谢变化参数发酵的各种工艺参数分为物理参数、化学参数和生物
学参数。（1）物理参数：包括温度、压力、流量、转速、补料和泡沫等，可直接在线测量和控制。①温度：是指发酵整个过程或不同阶段中所
维持的温度。其高低与发酵中酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物合成速率等有密切关系。不同产品，发酵不同阶
段所维持的温度亦不同。②压力：是发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内正压可防止外界空气中的杂菌侵入，同时与氧和二氧化碳在培养液中的溶
解度有关。③搅拌转速：与培养基中氧的传递、发酵液的均一性等有关。④搅拌功率：是指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液
所消耗的功率(kW·m-3)。大小与氧容量传递系数KLa有关。⑤空气流量：是指每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，也叫通风比
。一般控制在0.5L·L-1·min-1~1.0L·L-1·min-1。⑥粘度：是细胞生长及形态的一项指标，其大小可改变氧的传递
阻力，也可表示菌体的相对浓度。（2）化学参数：包括pH、溶解氧、氧化还原电势、二氧化碳溶解量、排气组分〔二氧化碳、氧气)和溶液成
分(总糖、总氨、各种无机离子等)，有些可直接在线检测，如pH、溶解氧和排气组分，有些不能或难以在线捡测。①基质浓度：是发酵液中糖
、氮、磷等重要营养物质的浓度。②pH：其高低与菌体的生长和产物合成有着重要的关系。③溶解氧:（3）生物参数发酵过程中的主要
生物学参数包括生物量、细胞数、细胞形态和大小、生物素、酶活性、辅酶、ATP、ADP、AMP、蛋白质、核酸、细胞活力等，它们一般不能
在线检测。①菌丝形态：菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程代谢变化和
决定发酵周期的依据之一。②菌体浓度：其大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响，与补料量、供气量、培养液的表观粘度和溶解氧浓度有关
。③脱氧核糖核酸(DNA)：以DNA为参数可以区分发酵的各个阶段。根据发酵液的菌体量和单位时间的菌体浓度、溶氧浓度、糖浓度、
氮浓度和产物浓度等的变化值，即可分别算出菌体的比生长速率、氧化消耗速率、糖化消耗速率、氮化消耗速率的产物比生成速率。这些参数也是
控制生长菌的代谢，决定补料和供氧工艺条件的主要依据，多用于发酵动力学的研究中。5.2温度对发酵的影响及其控制1．温度对发酵的
影响（1）温度对微生物细胞生长的影响；（2）温度对产物形成的影响；（3）温度影响发酵液的物理性质；（4）温度影响生物合成的
方向2．影响发酵温度变化的因素发酵热是发酵过程中释放出来的净热量，由产热因素和散热因素两方面决定的。Q发酵=Q生物＋Q搅拌－
Q蒸发－Q显－Q辐射（1）生物热(Q生物)：生产菌在生长繁殖过程中产生的热能，叫做生物热。发酵过程中生物热的产生具有强烈的时间
性；生物热也随培养基成分的不同而变化。（2）搅拌热(Q搅拌)：搅拌器转动引起液体之间、液体与设备之间摩擦所产生的热量。（3）蒸
发热(Q蒸发)：空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，排出空气引起水分蒸发所需的热能。水的蒸发热和废气因温度差异所带走的部分显热(Q显
)一起都散失到外界。（4）辐射热(Q辐射)：由于发酵罐内外温度不同，发酵液中有部分热通过主罐体向外辐射的热能。3．最适温度的选
择与发酵温度的控制（1）最适温度的选择：考虑两个方面，即微生物生长的最适温度和产物合成的最适温度。（2）温度的控制：工业发酵一
般不需要加热，多需要冷却。5.3pH对发酵的影响及其控制1．pH对发酵的影响(生长繁殖和产物合成)①影响酶的活性。②影响
微生物细胞膜所带电荷的状态。③影响培养基中某些组分中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用；④pH不同，引起菌体代谢
过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。⑤影响霉菌的形态。2．影响pH变化的因素发酵过程中pH的变化决定于所用的菌体、培
养基的成分和培养条件。发酵液的pH变化是菌体生化代谢反应的综合结果。从发酵过程中代谢曲线pH的变化就可以推测发酵罐中的各种生化
反应的进展和pH变化异常的可能原因。（1）发酸pH的确定微生物发酵的最适pH范围一般是在5~8之间，随菌体和产品不同而异，同一
菌种生长最适pH与产物合成最适pH往往不一样。最适pH是根据实验结果来确定的。温度变化可能影响最适pH变化。（2）pH的控制
①发酵培养基的配方，有些成分可在中间补料时补充调控。②加入适量的缓冲剂，控制培养基pH的变化，采用内源调节。③在发酵过程加酸
碱或其他物质进行调节。5.4溶氧对发酵的影响及其控制1．溶氧对发酵的影响工业发酵微生物多数为需氧菌，少数为厌氧菌。需氧
菌发酵过程，发酵液中溶氧浓度的控制是重要的控制参数之一。对抗生素发酵来说，氧的供给更为重要。但是需氧发酵并不是溶氧量愈大愈好
，适当的溶氧水平有利于菌体生成和产物合成，但溶氧太大有时反而抑制产物的形成。因此，为了正确控制溶氧浓度，需要考查每一种发酵产物的
临界浓度(C临界)和最适溶氧浓度，使发酵过程保持在最适浓度。最适溶氧浓度的高低与菌种特异性和产物合成的途径有关。初级代谢的氨基
酸发酵，需氧量的大小与氨基酸的合成途径密切相关。根据发酵需氧要求不同可分为三类：第一类有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸。经过
乙醛酸循环和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统两个途径形成的，产生的NADH量最多，NADH氧化再生的需氧量也最多。因此，它们在供氧充足的
条件下，产量才最大。第二类有异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸。它们的合成途径是产生NADH的乙醛酸循环或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮
酸羧化系统，产生的NADH量不多，与供氧关系不明显，在供氧充足的条件下可得最高产量，但供氧受限时对产量的影响并不明显；第三类有亮
氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。NADH产量很少，过量供氧反而起到抑制作用，仅在供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才能获得大量的氨基酸。
2．发酵过程的溶氧变化一定发酵条件下，每种发酵产物的溶氧浓度变化都有自己的规律。发酵过程中，有时会出现溶氧浓度明显降低或明显升
高的异常变化。其本质都是由耗氧或供氧方面出现了变化所引起的氧的供需不平衡所致。溶氧异常下降可能原因有：一是污染好气性杂菌，
消耗大量溶氧；二是菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降；三是某些设备或工艺控制发生故障或变化，引起溶氧下降等。在
供氧条件没有变化的情况下，耗氧量显著减少导致溶氧异常升高。如菌体代谢异常，耗氧能力下降，使溶氧上升，特别是污染烈性噬菌体，影响最
为明显，产生菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧有可能上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧就直线上升。因此，根据发酵液中
溶解氧浓度变化来判断微生物生长代谢是否正常，工艺控制是否合理，设备供氧能力是否充足等问题，有助于查找发酵不正常的原因和控制好发酵生
产。3．溶氧浓度的控制发酵液中的溶氧浓度是由供氧和需氧两方面决定的。氧的传递方程式为：Nv=KLa（C－CL）其中
，Nv为单位体积液体的传氧速率；KLa为以浓度差为推动力的体积溶氧系数；CL为溶液中氧的实际浓度；C为与气相中氧分压p平衡时溶液
中的氧浓度。在供氧方面，提高氧传递就是要设法增加推动力和液相体积氧传递系数KLa值，它与搅拌、空气线速度、空气分布器的形式、发
酵液的黏度等有关。而（C－CL）与发酵液的温度、氧分压、发酵液的性质等有关。发酵过程需氧量受菌体浓度、营养基质种类和浓度以及
培养条件等因素影响，菌体浓度的影响最明显。发酵液的摄氧率是随菌体浓度增加而成比例增加的，但氧传递速率是随菌体浓度对数关系减少。
因此，可通过控制菌体比生长速率略高于临界值，以达到最适浓度。最适菌体浓度即可保证产物比生长速率维持在最大值，又不会使需氧大于供氧
。菌体浓度可通过基质浓度来控制。还可采用调节发酵温度、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺措施来改善溶氧水平。5.5
泡沫对发酵的影响及其控制1．泡沫的形成及其对发酵的影响通气搅拌和代谢产生的气体是泡沫产生的原因。泡沫是气体被分散在少量液体中
的胶体体系，泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。按发酵液性质分为两种类型的泡沫：一类存在于发酵液的液面上，气相所占比例特别大
，并且泡沫与它下面液体之间有明显界线；另一种是出现在粘稠的发酵液中均匀而细的泡沫，比较稳定，其气相所占比例由下而上逐渐增加，气泡
与液面没有明显界限，此类泡沫又称为流态型泡沫。过多持久性泡沫会给发酵带来很多不利因素。如逃液、染杂菌、部分菌丝黏附在罐盖或罐壁
上而失去作用、影响通气搅拌正常进行，妨碍菌的呼吸，造成代谢异常或菌体自溶。2．泡沫控制好气性发酵过程，泡沫的消长有一定规律，与
通气、搅拌的剧烈程度有关，与培养基所用原料性质有关。了解发酵过程中泡沫的消长规律，可有效控制泡沫。泡沫控制方法主要包括机械消沫
和消沫剂消沫两大类。还可考虑从减少起泡物质和产泡外力，或从菌种选育方面考虑。（1）机械消沫：是一种物理作用，靠机械振动或压力
变化促使泡沫破碎。机械消沫又可分为罐内和罐外消沫两种。罐内消沫法，最简单的是在搅拌抽上部安装消沫桨；罐外消沫是将泡沫引出罐外
，通过喷嘴加速作用或利用离心力消除泡沫后，液体再返回主罐内。机械消沫节省原料，减少染菌机会。但仅作为消沫的辅助方法。（2）消
沫剂消沫：通过降低泡沫液膜机械强度，或者是降低泡沫液膜的表面黏度，或者兼有两者的作用，以达到破裂泡沫的目的。消沫剂应具有较小的表
面张力和较小的溶解度，对微生物细胞无毒，不影响氧的传递，能耐高温高压，浓度低效率高，对产品质量和产量无影响，成本低，来源广泛等。
工业常用消沫剂主要有：天然油脂类，高碳醇、脂肪酸和酯类，聚醚类，硅酮类(聚硅油类)等，使用最多的是天然油脂和聚醚类。天然油脂成本
相对较高，目前已有被合成消沫剂取代的趋势。聚醚类消沫剂品种最多，应用较多的是聚氧丙烯甘油(GP)和聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)，
又称泡敌。其他消泡剂，如聚乙二醇高级碳醇消沫剂多适用于霉菌发酵，硅酮类如聚二甲基硅氧适用于碱性细菌发酵。消泡剂多数是溶解度较
小、分散较差的高分子化合物，在使用时要设法降低其粘度、提高其分散性，即所谓消沫剂增效作用。方法有：①加载体增效，用“惰性载体”
(如矿物油、植物油等)使消泡剂溶解分散，达到增效的目的。②消沫剂并用增效，利用各种消沫剂优点进行互补，达到增效。③乳化增效，用
乳化剂(或分散剂)将消沫剂制成乳剂，以提高其分散能力，增强消沫能力。5.6补料的控制补料分批发酵也称做补料分批培养，是指在分
批培养过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，或称半连续培养或半连续发解。这种补料控制的明显效果是生产菌的
自溶期被推迟，生物合成期得到延长、可维持较高的产物增长幅度和增加发酵的总体积，从而使产量大幅度上升。1．补料的内容补充碳源和能
源物质；补充氮源物质；补充无机盐、微量元素。2．补料的方式及控制方式：连续流加、不连续流加和多周期流加。连续流加又可分为
恒速流加、指数流加和变速流加。流加操作控制系统分：有反馈控制和无反馈控制两种。它们的数学模型在理论上没有什么差别。反馈控制由传
感器、控制器和驱动器三个单元组成。根据控制依据指标不同，分为直接方法和间接方法。直接方法是以限制性营养物(如碳源、氮源)的浓度作
为反馈控制的参数。间接方法是以溶氧、pH、呼吸熵、排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制参数。为改善发酵液营养条件和去除部分
发酵产物，补料分批培养还可采用“放料和补料”方法，即定时放出一部分发酵液(可供提取)，同时补充一部分新鲜营养液后继续发酵，并重复进
行。5.7发酵终点的判断确定合适的微生物发酵终点对提高产物的生产能力和经济效益是很重要的。发酵过程中产物的生物合成是特定发
酵阶段的微生物代谢活动，有的是随菌体的生长而产生，如初级代谢产物氨基酸等，有的代谢产物产生与菌体生长无明显关系，如抗生素合成在生长的末期完成，因此要提高发酵单位和增加产量，通常采取延长周期的办法。但菌体细胞总不免要趋向衰老自溶，到后期，产物生产能力相应地减慢或停止，甚至下跌。因此合理地确定发酵周期，准确判断放罐时间，需考虑：（1）经济因素；（2）产品质量因素；（3）特殊因素。合理的放罐时间是由试验来确定的，根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵罐的生产力和产品成本，采用生产力高而成本又低的发酵时间作为放罐时间。异常发酵光密度曲线正常发酵溶氧曲线异常发酵溶氧曲线谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线红霉素发酵过程中溶氧和黏度的变化主要控制溶氧方法的比较耙式消泡浆典型分批发酵工艺流程分批发酵中微生物细胞的生长曲线发酵过程中的物理参数的测量方法和意义发酵过程中的化学参数的测量方法和意义 |
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