激光扫描共聚焦显微镜在园艺植物研究中的应用
王健，杨青，孟庆杰
(聊城大学生命科学学院，山东聊城252059)
摘要综述了激光共聚焦显微镜的原理以及激光扫描共聚焦显微镜技术在园艺植物细胞学、植物荧光方面、发育生物学和遗传学的应
用研究进展，并对其在园艺植物研究中的应用前景进行了展望。
关键词激光扫描共聚焦显微镜;园艺植物;荧光;花粉粒
中图分类号S126文献标识码A文章编号0517－6611(2016)03－007－02
ApplicationofLaserScanningConfocalMicroscopeinHorticulturalPlants
WANGJian，YANGQing，MENGQing-jie
(CollegeofLifeScienceandTechnology，LiaochengUniversity，Liaocheng，Shandong
252059)
AbstractTheprincipleoflaserscanningconfocalmicroscopeandtheresearchprogressonapplicationinhorticulturalplantpollenmorpholo-
gy，pollencytoskeleton，cytology，genetics，developmentalbiology，andplantfluorescencewerereviewed，theapplicationprospectinresear-
chesofhorticulturalplantswasforecasted．
KeywordsLaserscanningconfocalmicroscope;Horticulturalplants;Fluorescence;Pollengrains
基金项目山东省农业科技成果转化项目［鲁科农(2012)65号］。
作者简介王健(1986－)，男，山东东阿人，硕士，研究方向:植物学。
通讯作者，副教授，硕士生导师，从事植物学研究。
收稿日期2015-12-28
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是20世纪80年代中期发
展起来的一种无损深层形态结构分析的新技术，在医学、材料
学、生物科学、植物学等领域有着广泛应用。它是集显微技术、
高速激光扫描、电子摄像及计算机图像处理技术为一体的现代
高科技手段。该技术虽然已经深入生物学研究的各个领域，但
在园艺植物方面的研究中应用较少。鉴于此，笔者综述了
LSCM的原理以及激光扫描共聚焦显微镜技术在园艺植物细
胞学、植物荧光方面、发育生物学和遗传学的应用研究进展，以
期为该技术在园艺植物上的推广应用提供参考。
1LSCM的原理
LSCM是在不损害原有结构的基础上进行的一种深层形
态结构分析的新技术。由于不同的样品对激光发射器的要
求不同，常用的激光器有ArUV(351、364nm)、AR(457、488、
514nm)、HeNe(543、633nm)等。
LSCM的基本原理是运用紫外光或可见光的激光扫描束
通过光源针孔形成的点光源，对自己能发出荧光的标本或经
荧光染料标记后能发出荧光的标本的焦平面上进行逐点扫
描，激发其产生荧光。采集点的光信号通过探测针孔到达光
电倍增管，经光电倍增管检测出发射光的波长及强度，然后
经过计算机的转换，最终在显示屏上形成样品的二维和三维
图像。由于入射光源针孔及检测针孔与物镜焦平面的位置
是共轭的关系，所以进行点扫描时，焦平面上的点会同时聚
焦于光源针孔和检测针孔上，以便抑制在同一焦点平面上非
测点的散杂荧光以及来自样品中的非焦平面的荧光，从而达
到只有扫描点成像而其他的干扰点不会成像的目的，最终经
过逐点扫描形成整个标本的光学切片。目前，激光扫描共聚
焦显微镜具有高反差、高灵敏度、高分辨率等优点，可对样品
进行无损伤、逐层的扫描
［1－4］
。
2LSCM在园艺植物细胞学研究中的应用
2．1LSCM在花粉粒形态结构研究中的应用何川生等
［5］
利用LSCM技术对37种烟草花粉进行了观察，发现不同的
烟草花粉的形态结构有差异，而同一品种烟草花粉形态结构
较稳定，为烟草分类及其进化研究提供重要依据。李林光
等
［6］
利用LSCM技术对四倍体品种天星苹果及二倍体富士
苹果的花粉萌发力、花粉形态及胚囊发育特征进行观察研
究，寻找到天星苹果在结果方面不及富士苹果的原因，以便
更好地改进，培育出优良品种。李国平等
［7］
为了研究不能自
发荧光的黑松花粉管，对其进行荧光标记，然后利用LSCM
技术研究了其形态结构并观察了不同浓度的蔗糖对花粉管
生长的影响，进而对比了其与被子植物的不同。丁亮等
［8］
应
用LSCM技术对红花粉粒进行扫描，利用Laser-Sharp图像处
理软件重建其三维结构，并叙述了LSCM的成像原理、特点
以及在植物孢粉学研究中的应用前景。
2．2LSCM在花粉细胞骨架研究中的应用李国平等
［9］
用
4种不同的染色剂和染色方法对雪松花粉和花粉管进行染
色，在特定的激发光源下，通过试验发现经曙红－Hoechst
33342双染的雪松样品细胞核结构最清晰，建立了一种简便易
行、有效的制片程序，并用LSCM技术较好地展现了雪松花粉
和花粉管的细胞结构及其细胞核状态、行为。
李岩等
［10］
应用免疫荧光和荧光标记方法，结合LSCM技
术，观察百合花粉以及花粉管内微丝和微管的分布，结果表
明化学固定方法较好地保存花粉和花粉管内微丝;用免疫荧
光法标记发现微管大多分布在距离花粉管顶部10～20μm
的范围内;在花粉管中，存在共分布现象的微丝骨架与微管
骨架并不多，只有少数微丝与微管是相互平行排列的。
李国平等
［11］
利用LSCM技术和免疫荧光标记法对黑松
的花粉和花粉管中微管的骨架进行研究，通过在含秋水仙碱
的培养基中萌发的黑松与正常萌发的黑松花粉管的结构对
比，发现了含秋水仙碱的培养基中萌发的黑松花粉管顶端肿
胀产生的原因。研究表明，与被子植物相比，裸子植物花粉
管顶端的微管网络对花粉管顶端的形态及生长方向非常
重要。
徐霞等
［12］
以川百合花粉原生质体为材料，以微量DMSO
为渗透剂、Alex-phalloidin为探针的荧光标记，并结合LSCM
安徽农业科学，JournalofAnhuiAgri．Sci．2016，44(3):7－8，12责任编辑乔利利责任校对况玲玲
ChaoXing
技术，研究了蛋白质酪氨酸磷酸化作用参与花粉原生质体在
极性形成、花粉管萌发及花粉管生长过程中微丝骨架的列阵
变化。
2．3LSCM在细胞内、外Ca
2+
变化及其作为信号转导因子
的研究尚忠林等
［13］
以川百合花粉为材料，利用孵育法在
花粉原生质体中，特别是利用低温装载法在完整花粉粒中成
功地载入酯化形式的Ca
2+
荧光探针Fluo-3AM，并利用LSCM
技术对花粉细胞质中游离Ca
2+
的分布特点进行研究。
鲁振华等
［14］
采用LSCM技术，以Fluo-3AM-ester为荧光
探针研究桃果肉和叶柄组织中Ca
2+
的分布，结果表明Fluo-
3AM-ester可作为荧光探针对桃不同组织中游离的Ca
2+
信号
强度和分布特征进行分析，为进一步研究Ca
2+
对果实品质的
影响、合理喷施钙元素提供了理论依据。
郭光明等
［15］
利用LSCM技术观察低温装载有Ca
2+
荧光
探针Fluo-3的百合花粉细胞内游离Ca
2+
与培养基中硼酸的
关系。结果表明，硼能促进细胞外的Ca
2+
进入细胞内，维持
百合花粉细胞内游离Ca
2+
较高的浓度。
3LSCM在园艺植物荧光方面的应用
周建涛等
［16］
采用LSCM技术研究了外源钙调素(CaM)
及其抗血清对“丰水”梨白花(不亲和)和异花(亲和)授粉后
花柱自发荧光变化的影响。结果表明，外源CaM及其抗血
清对白花、异花授粉的生理代谢过程均有影响，为研究钙调
素在植物自交不亲和性反应中的作用提供了理论依据。
何川生等
［17］
利用LSCM技术对不同类型烟草材料的花
粉自发荧光强度进行了定量检测，发现不同类型及品种之间
花粉自发荧光强度存在明显差异，可作为烟草品种鉴别的重
要依据。
毕玉花等
［18］
以非洲菊为研究对象，对其生长发育过程
(P
1
～P
6
期)中外轮舌状花进行延迟荧光(DF)分析，并利用
LSCM成像系统对其各期表皮细胞中叶绿素的分布和相对含
量进行检测，以研究非洲菊外轮舌状花发育过程中延迟荧光
改变与其叶绿素变化的关系。
项海波等
［19］
根据蔬菜叶绿素荧光强度将随污染的程度
发生改变的原理，采用LSCM技术分析蔬菜受重金属污染后
叶绿素荧光强度的变化，建立了基于LSCM技术的蔬菜重金
属污染评价方法，进一步为进出口蔬菜的监管奠定了方法学
和技术理论基础。
茶树荧光性绿斑病是一种普遍发生的成叶生理性病害。
蒋淑媛等
［20］
将pH荧光探针BCECF/AM导入茶树荧光性绿
斑病病叶、正常叶片切片，利用LSCM技术测定胞内pH，结果
表明病害叶片胞内的pH与病害程度呈显著正相关。测定病
变叶片胞内pH有利于探明病变细胞的生理变化，对阐明其
发光机理以及发病机理有重要理论意义。
4LSCM在园艺植物发育学及相关领域中的应用
徐川梅等
［21］
利用LSCM技术，对孝顺竹雄配子体发育过
程进行观察，发现大部分孝顺竹单倍体小孢子经过2次有丝
分裂过程最终形成成熟的三细胞花粉粒，但约有38%的孢子
不能发育成正常的花粉粒，认为这可能是孝顺竹结实率低下
的原因。
朱东姿等
［22］
利用LSCM技术对甜樱桃品种“美早”和
“布鲁克斯”的雌配子体发育过程进行了观察。将甜樱桃胚
囊用戊二醛固定，脱水透明后直接采用LSCM进行观察，利
用该法观察到的雌配子体发育过程与用石蜡切片法观察的
一致，但是LSCM法更简便、省时、准确。
王颖等
［23］
利用LSCM技术对平邑甜茶与扎矮山定子杂
交获得6个皱叶矮生型株系的胚胎发育过程及发育特性进
行了观察与研究。结果表明，皱叶矮生型株系的胚胎发育特
征是以有性生殖为主的生殖方式，与亲本扎矮山定子的胚胎
发育特征较一致;与亲本平邑甜茶不同，未出现平邑甜茶胚
胎发育中的复杂现象，并表现出较弱的无融合生殖能力。
5LSCM在园艺植物遗传学上的应用
LSCM技术广泛应用于核酸分子杂交方面，与传统的原
位杂交技术相比，原位杂交的共聚焦技术具有操作简单、快
速、结果更清晰准确的优点，而采用LSCM对样品进行双色
标记和探测，尤其对小染色体原位杂交的定位特别有用，也
可在基因的表达和检测方面借助LSCM技术。李国平等
［24］
应用LSCM技术研究油杉小孢子的发生过程，油杉样品经曙
红－Hoechst33342双染和冬青油透明后，分别用488nm紫
外光进行扫描，结果表明，在LSCM下可较好地再现油杉小
孢子发生过程，清晰地显示出油杉花粉母细胞减数分裂过程
中核相的变化。
阎隆飞等
［25］
将运用反义基因技术构建成的植物不育基
因导入小麦和番茄中，获得大量转基因小麦和番茄植株，检
测分析表明导入的反义肌动蛋白在雄蕊，特别是在花药和花
粉中表达正确，使花药和花粉中内源肌动蛋白基因的表达得
到特异性的封闭或抑制，从而导致花药和花粉细胞畸形或无
活力，产生雄性不育。经LSCM观察转基因植株的花粉发现
花粉粒中的微丝明显减少，而雌蕊并不受影响。
罗果等
［26］
为观察外源hIL-12基因在转基因马铃薯不同
组织部位的表达情况，采集转基因马铃薯的茎和块茎组织进
行研究，以野生马铃薯为阴性对照，用间接荧光免疫标记法、
激光共聚焦显微镜观察hIL-12在转基因马铃薯不同组织中
的表达情况。结果表明，经LSCM检测，转基因马铃薯茎与
块茎中均有hIL-12的表达，而野生马铃薯中无hIL-12的
表达。
6LSCM的应用前景与展望
近年来出现的LSCM是一种图像分析仪器，有着独特的
激光扫描成像方式及精确的计算机测量定位系统，其与电子
显微镜、原子力显微镜、生物质谱、核磁共振等技术不断结
合，大大提高了分辨率，是普通显微镜和电子显微镜的飞跃
和补充，已经深入生物学研究的各个领域。但该技术还有一
些不足，如价格昂贵、对操作人员技术要求高、激发波长有限
等，限制了该技术的应用。目前，该技术在药用园艺植物方
面的应用也较少，但随着时间的推移，该技术在园艺植物方
面的研究将有更加广阔的前景。
(下转第12页)
8安徽农业科学2016年
ChaoXing
表5样品加标回收率的测定结果
Table5Detectionresultsofrecoveryrateofspikedsamples
样品编号
Sample
code
加标前Beforeadding
葡萄糖浓度
Glucose
concentration
mmol/L
木糖浓度
Xylose
concentration
mmol/L
总糖浓度
Total
saccharide
concentration
mmol/L
加标后Afteradding
葡萄糖浓度
Glucose
concentration
mmol/L
木糖浓度
Xylose
concentration
mmol/L
总糖浓度
Total
saccharide
concentration
mmol/L
加标回收率Recoveryrateofspikedsamples∥%
葡萄糖
Glucose
木糖
Xylose
总糖
Total
saccharide
14．020．844．866．100．726．82104．00－98．00
20．381．391．770．583．343．92－97．50107．50
3结论
笔者采用改进的双波长法测定了混糖溶液中木糖和葡
萄糖的含量，并对方法的回收率进行了测定，得出以下结论:
①选择550和400nm作为测定波长，可以使测定误差尽可能
小;②对于木糖在550nm处标准曲线的拟合，选择二次方程
拟合标准曲线有更宽的适用范围，尤其适合测定木糖浓度较
低的溶液;③葡萄糖显色反应在550nm处的吸光度要远小
于木糖，除非混糖溶液中葡萄糖的浓度远大于木糖，不必考
虑葡萄糖在550nm处的吸收;④在合适的木糖标准曲线选
择下，中配制的几种混糖样品的总糖、木糖和葡萄糖测定的
回收率均为94．00%～101．60%，对加标样品的测定也有较
高的准确度，说明该方法可以实现对总糖、木糖和葡萄糖含
量的准确测定。
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44－46．
(上接第8页)
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21安徽农业科学2016年
ChaoXing
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