苛养菌及少见菌分离培养与鉴定1苛养菌是指对营养要求苛刻，在普通培养基上不生长或难以生长的一类细菌；体外培养需添加特殊因子或其它营养成分。
苛养菌的分离鉴定是衡量一个细菌室技术水平的重要标志。流感嗜血杆菌肺炎链球菌苛养菌卡他莫拉菌淋病奈瑟菌（一）肺炎链球菌来源肺炎链
球菌（Streptococcuspneumoniae）简称肺炎球菌（pneumococcus）。1881年首次由巴斯德（Lo
uisPasteur）及G.M.Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双
或成短链状排列的双球菌，5%～10%正常人上呼吸道中携带此菌。临床意义肺炎链球菌(Streptococcuspneumoc
onia，SP)是儿童和成人肺炎的重要病原菌之一，存在于正常人口腔、鼻咽部，在机体抵抗力下降时致病。它引起肺炎、中耳炎、
乳突炎、鼻窦炎、细菌性脑膜炎、败血症等疾病，尤其对婴幼儿构成严重威胁。易感人群任何人，皆可被肺炎链球菌感染，但以下3类人士特别
容易受到侵袭：65岁以上人士；5岁以下儿童，特别是2岁以下的幼童；高危人群，如长期病患者等。以年龄层论，受肺炎链球菌侵袭，引致侵犯
性肺炎链球菌疾病的最高危者，是5岁以下的小儿，特别是2岁以下的幼童。一旦受到侵袭，死亡率最高的是年长的老人家及有长期病患的高危
人群。中国2011年妇幼卫生事业发展报告指出，肺炎位列中国五岁以下儿童死因的第二位，在重症肺炎中，约有50%是由肺炎链球菌引起的
。肺炎链球菌不仅是http://baike.so.com/doc/5345029.html小儿肺炎的主要“元凶”，也是引起肺炎死
亡的重要病原。婴儿从6月龄起母传抗体逐渐消失，因此6月龄到2岁是儿童侵袭性肺炎链球菌性疾病发病率最高的时期。致病力肺炎链球菌的
荚膜在细菌的侵袭力上起主要作用，有荚膜的SP有毒力，失去荚膜则独力减低或丧失。还可产生溶血素、紫斑产生因子、杀细胞素、皮肤致死
毒素等。根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原的不同可分为90个血清型，与疾病相关的血清型分布随时间、地点、年龄不同而变化。标本来源外阴分泌物
胸腔积液脑脊液血液等标本?痰肺泡灌洗液脓液耳分泌物应采用从深部咳出，选择铁锈色部分或脓性分泌物痰。培养基血琼脂平板：胰大豆蛋白胨琼
脂或哥伦比亚琼脂加5%绵羊血；加庆大霉素的血琼脂平板：在普通血琼脂中加入抑制剂庆大霉素注射液，混匀倾倒平板，琼脂中庆大霉素最
后浓度相当于1.25mg/250mL。标本接种及培养条件用鼻咽拭子采取患者鼻咽分泌物、痰、咽拭子、肺泡灌洗液等呼吸道标本接种
庆大霉素血平板或普通血平板，置于35℃，5~10%CO2温箱培养18-24血液、脑脊液标本等无菌体液标本可直接采用
血培养瓶进行培养。典型的肺炎链球菌菌落细小、圆形、呈脐窝状、较湿润、边缘整齐，直径0.5～1.5mm的菌落。不典型的肺炎链球
菌菌落有水滴样，菌落较大，边缘不整齐；还有细小、似草绿色链球菌但较湿润的菌落也需注意。菌落特点脐窝状粘液型细菌染色形态革兰氏染
色阳性，呈矛头状，成双或链状列，有荚膜；在痰标本中大多数成双排列。Optochin敏感胆汁溶菌鉴别要点荚膜肿胀试验菊糖分解试验阳
性Optochin(OP)敏感试验挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5μg/片的Optochin纸片，置5~
10%CO2的大气中（或烛缸），35℃孵育过夜。抑菌环直径>=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径<14mm时参
照胆汁溶菌试验。胆汁溶菌试验（1）试管法取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1
ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。（
2）平皿法加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已
知肺炎链球菌作阳性对照。荚膜肿胀试验取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用油镜检
查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。（二）流感嗜血杆菌临床意义流感嗜血杆菌常
寄生在人的咽喉及口腔粘膜，少见于消化道和生殖道，在呼吸道定植者可达人群的50%。当机体抵抗力下降时引起疾病。可随血液入侵组
织内部，引起脑膜炎、关节脓肿和其它部位化脓性感染。标本接种处理痰、咽拭子、血、分泌物、脑脊液等标本划线接种于流感嗜血杆菌选择性
培养基，放入5％CO2培养箱35~37℃孵育18～24h,菌落细小，可延长培养时间至48小时。与临床有关的有9个：流感嗜
血杆菌副流感嗜血杆菌溶血嗜血杆菌副溶血嗜血杆菌杜克雷嗜血杆菌埃及嗜血杆菌嗜沫嗜血杆菌副嗜沫嗜血杆菌迟缓嗜血杆菌代表菌：流感嗜血杆菌
培养特性营养要求比较特别，需要Ｘ、Ｖ因子存在及5～10%的CO2气体，最适生长温度37℃。培养基采用哥伦比亚琼脂加5%马血或
兔血制成巧克力琼脂，加入去甲万古霉素注射液或杆菌肽作为抑制剂，终浓度分别为6mg/300mL、76mg/250mL。用绵羊
血做巧克力时，需加入添加剂（OXOID公司产品，剂量按产品说明书）。培养特性需氧菌培养较为困难培养基中需加入血液，提供X、V因
子X因子—血红素V因子—辅酶I或辅酶II5～10%的CO2流感嗜血杆菌的纯培养形态在巧克力平板上形成微小、无色透明、呈露滴样小
菌落。48h后可形成灰白色、较大菌落。革兰染色形态特征流感嗜血杆菌为革兰氏阴性细小杆菌，从病灶中分离的菌株多呈球杆状或双
球状，有时可呈短链；在陈旧培养物中成多形态性，有长杆状和丝状；无芽孢、无鞭毛。卫星试验鉴定方法X、V因子需求试验卫星试验原
理有溶血性的细菌在羊血琼脂培养基上生长时可破坏红细胞释放出血红素(即X因子)和维生素B类物质(即V因子)，从而促进了流感嗜血杆
菌的生长；金黄色葡萄球菌在生长过程中能合成V因子释放于培养基中，当嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌一起培养时，V因子会促进嗜血杆菌的
生长，出现靠近葡萄球菌菌落的嗜血杆菌菌落较大，而远离葡萄球菌菌落的嗜血杆菌菌落较小的现象称为“卫星现象”；在不含血红素琼脂平
板上进行的卫星试验，称为“琼脂卫星试验”。X、V因子需求试验取无色透明，边缘整齐，露滴状菌落在哥伦比亚琼脂平板上均匀密划线，在
划线上贴X、V因子纸片，两纸片间距为20~22mm。经5％～10%的CO2培养箱，35~37℃孵育18～24h，在两纸
片中央出现细小菌落生长现象为阳性。嗜血杆菌属主要菌种?菌 名?流感嗜血杆菌埃及嗜血杆菌溶血嗜血杆菌嗜沫嗜血杆菌杜克雷嗜血副溶血嗜
血杆菌副流感嗜血杆菌副嗜沫嗜血杆菌 — + — + — 42 常见在次代培养不需要血红素;D.不同结果.X因子 V因子 溶血
CO2 触酶 G+C(mol%)++— — +— — +— +— —393939— 42— 3840~41+++++++—— （
+）+—++—+—+— DD40~41生化反应氧化酶试验阳性，分解葡萄糖，不分解蔗糖和乳糖，触酶和硝酸盐还原试验均为阳性。有荚
膜的菌株能产生吲哚，无荚膜菌株则不行致病性致病物质为内毒素、荚膜、菌毛和酶类通过呼吸道感染，引起原发性或继发性感染原发性感染多由
b型荚膜强毒株引起，为急性化脓感染，如脑膜炎、鼻咽炎、咽喉会厌炎、化脓性关节炎、心包炎等继发性感染主要在流感、麻疹、百日咳、肺结
核等后发生，多为无荚膜菌株引起。如慢性支气管炎、鼻窦炎等（三）卡他莫拉菌临床意义卡他莫拉菌（M.catarrhalis）原属奈瑟
菌属，1970年分类为布兰汉菌(Branhamella)，1984年（伯杰分类细菌学手册）列为莫拉菌属(Moraxella)的
一个亚属（SubgenusBranhamella）。该菌寄居于人类的鼻烟部，也可引起人类多种感染。如急性中耳炎、上颌窦炎和下
呼吸道感染，也可引起脑膜炎、心内膜炎、尿道炎，婴儿和儿童眼结膜炎、角膜炎和败血症等。该菌产生β-内酰胺酶的菌株渐多，为临床治
疗带来一定困难。培养特点本菌生长不需要特殊营养条件，需氧，在血平板、巧克力平板及营养琼脂平板上均能生长。在5~10%CO2环境
中，35℃培养过夜，可形成直径1~3mm的菌落。菌落圆形、凸起、无色、不溶血，推刮易碎不沾环，用接种环刮取的菌苔可呈淡奶色，在盐
水中不易乳化。有些菌株在初分离时，菌落可微微凹陷在琼脂中。革兰染色形态特征本菌为革兰阴性球菌，直径0.6~1.0μm，无芽孢
、无鞭毛，呈单或成双存在，成双时，两菌相对呈肾形。生化反应特点本菌不分解碳水化合物，硝酸盐还原试验阳性，氧化酶及触酶试验均阳
性，DNA酶和乙酰脂酶阳性。DNA酶试验鉴别方法乙酰脂酶试验DNA酶试验挑取可疑菌落，涂抹接种于DNA琼脂平板上(涂抹菌斑直径
5-10mm)，以金黄色葡萄球菌ATCC25923作为阳性对照，放入35℃孵箱培养24-48h后，于DNA琼脂上加1NH
CL溶液1-2ml(铺满琼脂表面)，10分钟后观察结果：菌斑周围或菌斑下(刮去菌斑)出现无色透明区即为DNA酶阳性。乙酰脂酶
试验用无菌生理盐水将3-乙酰吲哚纸片沾湿，取待检菌落涂在纸片上，3分钟内出现蓝绿色为阳性反应。以卡他莫拉菌ATCC2523
8，全国临检中心质控菌株9602、9707、0101作为阳性对照。少见菌44棒状杆菌属棒杆菌属的细菌为革兰阳性直或微弯曲的杆菌
，纵边不平行，有的末端略膨大呈棒形。棒杆菌常成对并排，V形，栅栏状或呈簇状排列，细胞很少着色不均，不分枝，无抗酸性。通常细胞内
有异染颗粒，与医学相关的种均无动力。培养特性棒杆菌需氧或兼性厌氧，杰氏棒杆菌不能在厌氧条件下生长。与医学相关的棒杆菌均可在含有
5％的羊血琼脂平板上良好生长。最适生长温度为35～37℃。不能在麦康凯琼脂上生长。45棒状杆菌属杰氏棒杆菌革兰染色接近棒杆菌血
平皿菌落46棒状杆菌属以下情况分离到棒杆菌更具有临床意义：多份标本部分离到同样的棒杆菌。标本直接涂片革兰染色镜下见到棒杆菌，并观察
到强烈的白细胞反应。从同一标本中分离到的其他细菌的致病性低。以下情况下分离到的棒杆菌需要鉴定到种的水平：从无菌的体液标本中分离出
的捧杆菌(多份标本中只有一份为阳性时除外)。 严格按操作规程采集的标本中分离出的棒杆菌，而且是优势菌时。从尿标本分离出单一的棒
杆菌，细菌计数大于104CFU/ml，或是优势菌细菌计十数大于105CFU/ml时。47单核细胞增生李斯特菌李斯特菌为革兰阳性短杆
菌，不分枝，无芽胞，长05- 2um，宽0.4-0.5um，菌体细胞呈单个或短链状，培养时间延长或粗糙型培养物可呈丝状菌
体(6-20um)。有1-5根周鞭毛，在室温下运动活泼，在35℃时失去动力或运动非常缓慢，此特征可作为初步判定。 李斯特
菌为兼性厌氧菌，在含5％羊，马兔血的胰大豆胨琼脂平皿上生长良好。最适生长温度为30-37℃．能在4℃下缓慢生长。48单核细胞增
生李斯特菌单核细胞增生李斯特菌伊氏李斯特菌49单核细胞增生李斯特菌CAMP实验是鉴定单核细胞增生李斯特菌及其他李斯特菌的重要试
验之一。本菌CAMP试验的加强溶血区不是箭头状而是长方形。用马红球菌做CAMP试验时单核细胞增生李斯特菌呈阴性或弱阳性，
伊氏李斯特菌为阳性。50诺卡菌属革兰氏染色：革兰氏阳性或不定，无芽孢和鞭毛。菌体呈多向的分枝丝状，直径0.5-1.2μm。培
养早期可见丰富的菌丝体，常有次级分枝。培养后期菌体裂解为球形或杆状。星形奴卡菌巴西奴卡菌星形奴卡菌51诺卡菌属星形奴卡菌72h
星形奴卡菌24h52诺卡菌属改良抗酸染色为弱阳性（1%硫酸水溶液），呈不均匀性，易被脱色呈阴性。星形奴卡菌星形奴卡菌奴卡菌53
诺卡菌属痰标本直接涂片革兰氏染色可见典型的分枝菌丝，菌丝呈90°分枝角。有时不易着色或不均匀。痰涂片菌丝呈90°分枝痰涂片
菌丝团痰涂片着色不均54诺卡菌属组织中细菌易聚集形成团块或微粒，在脓性分泌物中肉眼可见“硫磺颗粒”血培养涂片革兰氏染色痰涂片
弱抗酸染色55诺卡菌属星形诺卡菌培养2d56诺卡菌属属间鉴定诺卡菌属于其他需氧放线菌属如链霉菌属、拟诺卡菌属、红球菌属、马杜拉放
线菌属以及棒状杆菌等形态形似的革兰氏阳性杆菌的属间鉴定：与链霉菌属、放线菌属和拟诺卡菌属的鉴别四者镜下形态均为分枝丝状，但诺卡菌
属改良抗酸染色弱阳性，后者阴性。革兰氏染色菌丝与孢子链57诺卡菌属白色链霉菌拟诺卡菌MHA，9d，气生菌丝58诺卡菌属与红球菌属
的鉴别两者均可呈现弱抗酸性，但马红球菌不产生气生菌丝。马红球菌48h粘液型马红球菌SBA粗糙型59诺卡菌属马红球菌24h
弱抗酸马红球菌5d革兰氏染色60诺卡菌属与棒状杆菌的鉴别棒状杆菌不形成菌丝，菌体呈栅栏状排列。61诺卡菌属临床意义：诺卡菌在
自然界分布广泛，多为腐生寄生菌，与人类关系最大的是星形诺卡菌复合体（星形、鼻疽和新星，引起90%的非皮肤部位感染）；巴西诺卡菌
（热带的足分枝菌病和非热带肺部感染，CNS），多为外源性感染足分枝菌病：巴西诺卡菌，热带地区，可通过损伤的皮肤侵犯皮下组织，
产生慢性化脓样肉芽肿，表现为脓肿及多发性瘘管，好发于足和腿部。孢子丝菌病：星形诺卡菌，皮肤淋巴肺部-吸入性：星形诺卡菌，慢性，X
光显示渗入性结节，空洞，多结节，类似结核病。星形诺卡菌肺炎患者的痰标本呈肺结核样乳酪样痰。播散性：由肺部感染引起，90%为星形
诺卡菌，CNS占40%，脓肿或肉芽肿；其他部位：眼，肾，关节，心脏。62诺卡菌属鉴定要点：弱抗酸染色（改良抗酸染色）必须标准化。
涂片染色与分离培养必须结合取长补短。加强与临床沟通使检验结果转化为临床治疗更能及时有效。63形态学检查在细菌鉴定中的关键作用菌
体形态观察通过观察菌体形态为鉴别细菌提供手段细菌菌体形态结合菌落形态特征可对细菌进行鉴别。例如，在选择性巧克力平板（加万古
霉素）上生长的草绿色溶血菌落，是乳杆菌还是肠球菌（VRE）只要涂片镜检就很容易区分；鲍曼不动杆与克雷白菌属细菌的菌落形态相似，
区别在于前者为革兰阴性球杆菌（接近球菌），后者为革兰阴性杆菌；丹毒丝菌在血平板上的菌落形态与草绿色链球菌很相像，但镜下形态差别
很大。64形态学检查在细菌鉴定中的关键作用肺炎克雷伯菌拉丝现象诺卡菌65形态学检查在细菌鉴定中的关键作用菌体特殊结构的观察荚膜
荚膜是某些细菌在细胞壁外包裹的一层粘液性物质，不同的细菌其荚膜成分也有一定差异，一般由多糖、多肽或蛋白质组成。荚膜作为细菌的
毒力因子有必要对其染色观察，但荚膜染色对于临床标本分离菌株的鉴定价值并不大。鞭毛观察细菌鞭毛对于细菌鉴定具有重要的价值。依
据鞭毛位置和数量，细菌分为单端极鞭毛菌、单端双鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。鞭毛是细菌的动力器官，大多数情况下可用
动力试验验证细菌鞭毛的存在，但动力试验无法代替鞭毛染色在细菌鉴定中的地位。图8所示为霍乱弧菌鞭毛染色结果。66形态学检查在细菌
鉴定中的关键作用芽胞芽胞的形态包括芽胞形状、芽胞位置和孢子囊膨大。芽胞形态分为圆柱形、椭圆形、球形，芽胞位置分为端生、近端生
、中生或近中生。根据芽胞的形态学可以进行芽胞杆菌属和梭菌属的鉴定。芽胞染色并不优于革兰染色，使用相差显微镜观察芽胞优于芽胞染色和革兰染色。图9所示为艰难梭菌芽胞染色结果。异染颗粒其主要成分是多聚偏磷酸盐，可随菌龄的延长而变大。多聚磷酸盐颗粒对某些染料有特殊反应，产生与所用染料不同的颜色，因而得名异染颗粒。如用甲苯胺蓝、次甲基蓝染色后不呈蓝色而呈紫红色。棒状杆菌和某些芽胞杆菌常含有这种异染颗粒。白喉棒状杆菌异染颗粒位于菌体两端，故又称极体，有助于该菌的鉴定。图10所示为白喉棒状杆菌异染颗粒染色结果。67形态学检查在细菌鉴定中的关键作用普通变形杆菌周鞭毛白喉棒杆菌异染颗粒68形态学检查在细菌鉴定中的关键作用临床微生物学实验室常规鉴定细菌离不开形态学检查,很难想象革兰染色和形态学检查错误会得到正确的鉴定结果，形态学检查对鉴定细菌起着“导航”作用，具有重要的价值，临床微生物学检验工作者应予重视。69感谢您的聆听70 |
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